Giải pháp chống virus gây bệnh đốm trắng

 Vi rút gây bệnh đốm trắng có đến 531 gien (gene) giả định, một vài trong số đó rất quan trọng trong việc nhân rộng vi rút gây bệnh. Hầu hết các gien gây bệnh có vai trò nhất định trong việc tiêm nhiễm vi rút. Một vài nghiên cứu đã sử dụng can thiệp gien RNA để kiểm soát gien gây bệnh đốm trắng, giải mã các protein có liên quan đến cấu trúc của vi rút. Một số nghiên cứu khác cũng đã đánh giá hiệu quả chống vi rút của các protein WSSV không cấu trúc.

Việc ứng dụng hiệu quả công nghệ gây bất hoạt gien RNAi phụ thuộc vào gien đích. Các gien gây bệnh đốm trắng lặn có vai trò quan trọng trong việc nhân rộng các vi rút có khả năng chống vi rút hiệu quả hơn, do vậy giảm tỷ lệ chết ở tôm.

Mục đích của nghiên cứu này nhằm đánh giá hiệu quả chống vi rút của mạch kép RNA đối với gen gây bệnh đốm trắng f89 và wsv191 trên tôm thẻ chân trắng.

Thiết lập thí nghiệm

Các nhà khoa học đã thành lập một nghiên cứu đánh giá hiệu quả của sợi kép (ds) RNA ở gien không cấu trúc là orf89 và wsv191 so với hai gien cấu trúc vp26 và vp28 của virus đốm trắng để chống lại WSSV trong cùng điều kiện thí nghiệm.

Tôm trong thí nghiệm được lấy từ một trại giống ở Sonora, Mexico và đã được xét nghiệm PCR cho kết quả âm tính với WSSV. Các con tôm này được nuôi trong môi trường thí nghiệm với độ mặn 25‰, nhiệt độ 27 ± 2 độ C và được sục khí liên tục. Định kỳ cứ 3 ngày thay thay 50% nước/lần để duy trì chất lượng nước. Sau đó, tôm được tiến hành gây nhiễm từ tôm bị nhiễm WSSV ngoài tự nhiên từ Sinaloa, Mexico.  Với nồng độ được pha loãng từ 102 – 107, tôm được gây nhiễm WSSV và nuôi trong môi trường thí nghiệm nước mặn ở bể có thể tích 12 lít.

Tôm được theo dõi 2 lần/ngày về dấu hiệu lâm sàng nhiễm WSSV và tỷ lệ chết trong 10 ngày. Nồng độ chuẩn gây nhiễm bệnh và chết ở tôm được xác định là 105.6 SID50/mL and 105.6 L.D.50/mL. Ở nồng độ SID50 tỷ lệ tôm bị nhiễm bệnh là 50%. LD-50 là liều duy nhất gây chết đến 50% nhóm tôm thí nghiệm.

RNAi chống lại WSSV gồm bốn gen vp26, vp28, wsv191 và orf89 được sản xuất như là dsRNA, sử dụng bộ phiên mã theo quy định của nhà sản xuất.

Phương pháp điều trị

Các nhà khoa học đã tiến hành thí nghiệm trên các nhóm khác nhau, mỗi nhóm gồm 10 con tôm thẻ chân trắng đã gây nhiễm WSSV được theo dõi trong 24h và được nuôi trong bể 80 lít có độ mặn 25‰, nhiệt độ 25 ± 2 độ C, sục khí liên tục. Mỗi nhóm được tiêm lần lượt vào cơ thể với một trong những dsRNA với liều 4 µg.

Một nhóm 10 tôm thẻ chân trắng được tiêm với liều lượng 40 µl dsRNA chống lại vi khuẩn lacZ và được sử dụng làm nhóm đối chứng. Một nhóm khác gồm 10 con tôm được điều trị bằng 40 µl hệ đệm phosphat và sử dụng làm đối chứng dương. Mỗi nghiệm thức được lặp lại 3 lần.

Sau 48h, tất các con tôm nhiễm WSSV trong bể thí nghiệm tiếp tục được tiêm vào cơ thể với liều cao (2.500 SID50trong 50 µl). Tôm được theo dõi với tần suất 2 lần/ngày trong vòng 10 ngày sau khi bị phơi nhiễm để ghi lại các dấu hiệu lâm sàng và tỷ lệ chết của bệnh. Số lượng tôm gần chết và chết được ghi lại, lấy ra khỏi bể và tiến hành lấy mẫu mô nhiễm WSSV để kiểm tra.

Vào cuối thí nghiệm, những con tôm sống sót được sử dụng để tách chiết RNA và phân tích PCR với WSSV. Hiệu quả kháng virus của dsRNA khác nhau được đánh giá bằng tỷ lệ chết và số lượng tôm bị nhiễm WSSV.

Các kết quả

Nhóm thí nghiệm và điều trị tôm nhiễm WSSV bằng dsRNA của vi khuẩn LacZ là nhóm đầu tiên cho thấy các dấu hiệu lâm sàng ở tôm như giảm ăn, bơi lội thất thường, lờ đờ sau 24h tiêm. Tỷ lệ chết đầu tiên được ghi nhận sau 36h tiêm, và tỷ lệ chết 100% sau 108h, tất cả tôm xét nghiệm PCR đều cho kết quả dương tính với WSSV.

Đối với nhóm được sử dụng dsRNA của gen vp28 cho thấy tôm chết đầu tiên sau 72h và tỷ lệ tôm sống sót là 7%. Đối với nhóm được sử dụng dsRNA của gen orf89, cho thấy tôm chết sau 108h và tỷ lệ tôm sống sót vào cuối thí nghiệm là 10%. Đối với nhóm được sử dụng dsRNA của gen vp26, cho thấy tôm chết đầu tiên sau 84h và tỷ lệ tôm sống sót vào cuối thí nghiệm là 21%. Đối với nhóm được sử dụng dsRNA của gen wsv191, cho thấy tôm chết đầu tiên là sau 24h và tỷ lệ tôm sống sót vào cuối thí nghiệm là 83%. Tất cả những con tôm chết đều cho kết quả kiểm tra PCR dương tính với WSSV. Những con tôm còn sống sót không có các dấu hiệu lâm sàng của bệnh WSSV và cho kết quả âm tính với WSSV khi xét nghiệm PCR.

Phản ứng chống vi rút

Một liều dsRNA duy nhất với liều lượng 4µg/con tôm là đủ để kích hoạt để gây ra phản ứng chống vi rút WSSV. Việc tiêm dsRNA giúp gây ức chế sự sao chép vi rút và giảm tỷ lệ chết ở tôm được điều trị. Cuối các nghiệm thức, hầu hết những con tôm được điều trị để chống lại WSSV bằng sợi RNA mạch kép đều sống sót và có tỷ lệ nhiễm WSSV thấp. Ngược lại, tôm được điều trị bằng chuỗi RNA mạch kép độc lập của vi khuẩn LacZ bị nhiễm WSSV và chỉ sống sót được trong một thời gian ngắn.

Tôm được điều trị với dsRNA của vp28 và vp26 có khả năng chống lại được vi rút WSSV. Do gien vp28 và vp26 có khả năng mã hóa các protein cấu trúc VP28 và VP26, mà các protein cầu trúc này lại đóng vai trò quan trọng trong cấu trúc virion và khả năng lây nhiễm của vi rút.

Khi sử dụng RNA mạch kép của hai gien phi định hình orf89 và wsv191 để chống lại WSSV cho thấy gen orf89 đã có hiệu quả trong việc làm giảm khả năng nhân rộng vi rút và giảm tỷ lệ chết ở tôm tương tự như gen cấu trúc vp28. Ngược lại, dsRNA của gen wsv191 có tác dụng chống lại vi rút kém nhất trong bốn loại gen được sử dụng trong thí nghiệm.

Triển vọng

Các chức năng của 2 protein không cấu trúc được mã hóa bởi các gien WSSV có thể giúp giải thích sự khác biệt trong hoạt động kháng vi rút. Gien orf89 quy định việc ngăn chặn quá trình sao chép của vi rút và mã hóa protein của vi rút. Vì vậy, gien này đóng vai trò quan trọng trong trong việc gây nhiễm và nhân rộng vi rút. Ngược lại, gien wsv191 không phải là một gien thiết yếu trong việc nhân rộng WSSV, mặc dù thực tế nó có thể mã hóa hoạt động của cả DNAse và RNAse. Sự tác động của nó không có ý nghĩa đến việc ức chế sự sao chép của vi rút.