Sử dụng bột đậu tương lên men bằng Monascus purpureus M-32 cho tôm thẻ

Tuy nhiên, việc áp dụng SBM ở động vật thủy sản còn hạn chế do có nhiều yếu tố kháng dinh dưỡng như lectin, kháng nguyên, chất ức chế trypsin và oligosaccharides, có thể có tác động tiêu cực đến sức khỏe đường ruột, việc sử dụng thức ăn, hiệu suất tăng trưởng và phản ứng miễn dịch không đặc hiệu của động vật thủy sản. Quá trình lên men được xác định là một phương pháp hiệu quả để loại bỏ các yếu tố kháng dinh dưỡng và chuyển hóa các chất dinh dưỡng đa phân tử thành các chất dinh dưỡng phân tử nhỏ. Hơn nữa, vi khuẩn có thể mang lại cho SBM những chức năng mới bằng cách tiết ra các thành phần chức năng như exoenzym, vitamin, peptide kháng khuẩn và các axit béo chuỗi ngắn khác nhau. 

Monascus là một nhóm nấm sợi, có thể tạo ra nhiều chất chuyển hóa thứ cấp với nhiều hoạt tính sinh học khác nhau như kháng khuẩn, chống viêm, từ đó điều hòa hệ vi sinh vật đường ruột. Trong các nghiên cứu trước đây, các nhà khoa học đã phân lập và xác định Monascus purpureus M-32 (số đăng nhập CGMCC 19377) từ lúa mốc đỏ thực phẩm truyền thống của Trung Quốc và xác nhận rằng nó có lợi cho tôm thẻ chân trắng. Do đó, M. purpureus M-32 được chọn làm chủng ưu tiên để lên men SBM nhằm cung cấp nguyên liệu protein chức năng cho loài này.

Chủng M. purpureus M-32 được ủ trên môi trường thạch khoai tây dextrose ở 30°C trong 7 ngày. Các bào tử trưởng thành được rửa bằng 2 mL nước vô trùng và chuyển vào các ống vô trùng 50 mL. Các cụm bào tử bị phá vỡ bằng cách sử dụng máy dao động trong 30 giây để thu được huyền phù bào tử của M. purpureus M-32. Huyền phù bào tử được cấy vào môi trường hạt giống lỏng (3,50% bột gạo, 1,20% peptone đậu nành, 1,20% glucose, 0,10% KH₂PO₄, 0,10% NaNO₃, 0,05% MgSO₄·7H₂O, pH 7,0) ở mức cấy 1%, sau đó cho hạt giống vào dạng lỏng của M. purpureus M-32 thu được bằng nuôi cấy lắc ở 30°C và 220 vòng/phút trong 3 ngày. Cơ chất lên men rắn bao gồm 1 kg SBM, 12 g glucose, 1 g KH₂PO₄, 1 g NaNO₃, 0,5 g MgSO₄·7H₂O và 250 mL nước.

Sau đó, 1 L chất nền lên men rắn (dày 5 cm) và 150 mL giống giống M-32 được đặt vào chai hình tam giác vô trùng 2 L và lắc đều. Nó được ủ ở 30°C trong khoảng 10 ngày và đảo mỗi ngày một lần để đảm bảo quá trình lên men đều. Quá trình lên men kết thúc khi sợi nấm của chủng M-32 phát triển khắp môi trường và chuyển sang màu đỏ. Cuối cùng, SBM lên men được sấy khô ở 60°C, nghiền nát và đưa qua lưới 0,18 mm. 

Bột cá, SBM và MFSM được sử dụng làm nguồn protein chính trong thí nghiệm. Lecithin, dầu cá và dầu đậu nành được sử dụng làm nguồn chất béo chính. 30% bột cá và 30% SBM được đưa vào khẩu phần cơ bản (đối chứng); và 20% (MFSM20), 40% (MFSM40) và 60% (MFSM60) SBM trong khẩu phần cơ bản đã được thay thế bằng MFSM trong các nhóm thử nghiệm (Bảng 1). 

 Bảng 1. Thành phần và hàm lượng dinh dưỡng của các khẩu phần thí nghiệm (%, VCK)

Tôm được nuôi trong 1 tuần với độ mặn 32‰ đến 34‰ với nhiệt độ nước 30°C. Thí nghiệm được chia ngẫu nhiên thành bốn nhóm (Control, MFSM20, MFSM40 và MFSM60). Có 3 lần lặp lại trong mỗi nhóm và 40 cá thể tôm trong mỗi lần lặp lại (trọng lượng ban đầu = 2,16 g). Tôm được cho ăn chế độ ăn đối chứng và ba chế độ ăn thử nghiệm (Bảng 1) trong 6 tuần. Trong quá trình thí nghiệm, 1/4 lượng nước canh tác được thay mới hàng ngày. Tôm được cho ăn khẩu phần tương ứng 3 lần/ngày (08:00, 13:00, 18:00). Thức ăn dư thừa được loại bỏ sau 2 giờ cho ăn. Trong quá trình thí nghiệm, tình trạng sức khỏe của tôm được quan sát trong mỗi bữa ăn và ghi nhận tôm chết và loại bỏ tôm chết kịp thời. 

Ảnh hưởng của quá trình lên men đến protein hòa tan của SBM 

Kết quả của SDS-PAGE (Hình S1) cho thấy cấu hình protein hòa tan của SBM thay đổi rất nhiều trước và sau khi lên men. SBM trước khi lên men chứa chủ yếu là các protein cao phân tử có trọng lượng phân tử lớn hơn 34 kDa. Trọng lượng phân tử của protein hòa tan trong SBM lên men hầu hết đều nhỏ hơn 25 kDa. Protein lớn hơn 49 kDa trong SBM gần như bị phân hủy hoàn toàn trong quá trình lên men. 

Ảnh hưởng của quá trình lên men đến thành phần dinh dưỡng và protein kháng nguyên của SBM 

Sự thay đổi hàm lượng protein thô, protein tan trong axit, thành phần axit amin, ergosterol và protein kháng nguyên trong SBM trước và sau lên men được trình bày ở Bảng 2. Hàm lượng protein thô của SBM tăng từ 46,03% lên 51,60% sau quá trình lên men, hàm lượng protein tan trong axit tăng gần 4 lần, từ 5,36% lên 19,16%. Hàm lượng các loại axit amin đều tăng, trong đó axit glutamic tăng cao nhất, từ 9,07% đến 10,57%. Hàm lượng ergosterol, chất chuyển hóa của M. purpureus, đạt 149,15 μg/g sau khi lên men.  

Bảng 2. Thành phần dinh dưỡng và hàm lượng protein kháng nguyên của bột đậu nành (SBM) trước và sau khi lên men (%, VCK)

Ảnh hưởng của việc thay thế SBM bằng MFSM đến hiệu suất tăng trưởng của tôm 

Như được trình bày trong Bảng 3, tốc độ tăng trọng (WGR) (P = 0,006) và tốc độ tăng trưởng riêng (SGR) (P = 0,002) của tôm ở nhóm MFSM cao hơn đáng kể so với nhóm đối chứng. Tỷ lệ chuyển đổi thức ăn (FCR) ở các nhóm thử nghiệm thấp hơn đáng kể so với nhóm đối chứng (P 0,001) và FCR giảm dần khi tăng mức MFSM, nhưng không có sự khác biệt đáng kể giữa 3 nhóm thử nghiệm ( P = 0,207). Tỷ lệ sống (SR) ở nhóm MFSM60 cao hơn đáng kể so với nhóm đối chứng (P = 0,005), nhưng không có sự khác biệt đáng kể giữa nhóm MFSM60 và hai nhóm thử nghiệm còn lại (P = 0,289). SR của nhóm MFSM20 và MFSM40 cao hơn nhóm đối chứng nhưng không có sự khác biệt đáng kể (P = 0,162). 

Bảng 3. Hiệu suất tăng trưởng của tôm trong thí nghiệm

Ảnh hưởng của việc thay thế SBM bằng MFSM đến khả năng chống oxy hóa ở gan tụy của tôm  

Như thể hiện trong Bảng 4, hoạt tính glutathione peroxidase trong gan tụy của tôm thẻ ở các nhóm thử nghiệm cao hơn so với nhóm đối chứng, nhưng không có sự khác biệt đáng kể (P = 0,126). Hàm lượng malondialdehyd (MDA) ở nhóm thực nghiệm thấp hơn đáng kể so với nhóm đối chứng (P = 0,007) và nhóm MFSM20 có hàm lượng thấp nhất. Tuy nhiên, hàm lượng MDA không khác biệt đáng kể giữa 3 nhóm thử nghiệm (P = 0,108). Hoạt tính của superoxide effutase (SOD) ở các nhóm thử nghiệm cao hơn đáng kể so với nhóm đối chứng (P = 0,002). 

Bảng 4. Khả năng chống oxy hóa trong gan tụy của tôm trong thí nghiệm

Ảnh hưởng của việc thay thế SBM bằng MFSM đến các chỉ số sinh hóa huyết thanh của tôm  

Như thể hiện trong Bảng 5, hoạt tính của phosphatase axit, phosphatase kiềm và phenol oxydase trong huyết thanh của tôm thẻ ở nhóm thử nghiệm cao hơn so với nhóm đối chứng nhưng không có sự khác biệt đáng kể. Hoạt tính của lysozyme ở nhóm MFSM60 cao hơn đáng kể so với nhóm đối chứng MFSM20 và MFSM40 (P = 0,006), tuy nhiên, không có sự khác biệt đáng kể giữa hai nhóm thử nghiệm còn lại (MFSM20 và MFSM40) và nhóm đối chứng (P = 0,388).  

Bảng 5. Các chỉ số sinh hóa huyết thanh trong gan tụy của tôm trong thí nghiệm

Ảnh hưởng của việc thay thế SBM bằng MFSM đến canxi và phospho trong máu và cơ tôm  

Như trình bày trong Bảng 6, hàm lượng Ca²⁺ trong cơ thịt tôm ở nhóm MFSM40 và nhóm MFSM60 cao hơn đáng kể so với nhóm đối chứng và nhóm MFSM20 (P = 0,001), và sự khác biệt tăng lên đáng kể khi tăng tỷ lệ thay thế . Hàm lượng PO₄^3- trong cơ tôm ở nhóm MFSM60 cao hơn đáng kể so với nhóm đối chứng, nhóm MFSM20 và MFSM40 (P = 0,006). Không có sự khác biệt đáng kể về hàm lượng PO43- (P = 0,107) và Ca2+ (P = 0,137) trong máu giữa nhóm thử nghiệm (MFSM20, MFSM40 và MFSM60) và nhóm đối chứng.

Bảng 6. Kết quả về hàm lượng canxi và phốt pho trong máu và cơ thịt tôm trong thí nghiệm

Tỷ lệ chết cộng dồn của tôm thẻ sau khi cảm nhiễm với V. parahaemolyticus 

Thí nghiệm cảm nhiễm V. parahaemolyticus được thực hiện trong 7 ngày và hầu hết tôm chết trong vòng 1 đến 3 ngày sau khi cảm nhiễm. Như được hiển thị trong Hình 1, MFSM có thể làm giảm đáng kể tỷ lệ chết cộng dồn của tôm sau khi bị nhiễm V. parahaemolyticus. Ở nhóm đối chứng, tỷ lệ chết trong ngày đầu tiên là 40% và tỷ lệ chết tích lũy trong ngày thứ ba đạt 73,30%, sau đó ổn định. Trong khi đó, ở nhóm MFSM20 và MFSM40 tôm chết chủ yếu vào ngày đầu tiên, tỷ lệ chết lần lượt là 6,67% và 3,33%, trong khi tỷ lệ chết cộng dồn của tôm được nuôi bằng MFSM60 là 0%. 

Tóm lại, sau khi lên men bởi M. purpureus M-32, hàm lượng protein thô và protein hòa tan trong axit trong SBM tăng lên, hàm lượng ergosterol đạt 149,15 μg/g. Trong khi đó, các protein cao phân tử bị phân hủy thành các protein có trọng lượng phân tử nhỏ hơn 25 kDa. Trong nghiên cứu này, MFSM được sử dụng để thay thế SBM trong khẩu phần cơ bản của tôm. Kết quả cho thấy FCR giảm và tăng trọng, tốc độ tăng trưởng đặc trưng và tỷ lệ sống của tôm được cải thiện. Khả năng chống oxy hóa và hoạt động của các yếu tố miễn dịch như hoạt động của lysozyme được cải thiện và khả năng chống nhiễm V. parahaemolyticus được tăng cường. Hàm lượng canxi và phốt photrong máu và cơ của tôm cũng được tăng cường đáng kể.