6 yếu tố ảnh hưởng đến việc bảo quản tinh trùng cá mú

Trong tự nhiên, cá mú cọp từ lúc nhỏ đến khi thành thục là con cái, sau đó chúng chuyển thành con đực khi đạt kích thước 120cm. Do đó trong thực tế, số lượng cá đực thường rất ít, và nguồn cá phục vụ cho sản xuất giống bị hạn chế. Nên việc nghiên cứu bảo quản tinh cá giúp cho quá trình thụ tinh được chủ động hơn, đơn giản trong việc vận chuyển cá bố mẹ, phục vụ lai tạo giống mới, khắc phục hiện tượng lệch pha đồng thời bảo tồn được nguồn gen.

Chất bảo quản

Chất bảo quản (hay còn gọi là Extender) là một dung dịch của muối vô cơ hoặc hữu cơ, có tác dụng bảo vệ sự sống của tế bào tinh trùng trong thời gian dài bảo quản. Chất bảo quản có thành phần gần giống như tinh dịch hoặc tế bào chất của tinh dịch. Điều này giúp đảm bảo cho tinh trùng có điều kiện sống gần giống như trong cơ thể. Các điểm cần lưu ý khi lựa chọn chất bảo quản:

• Có dinh dưỡng cần cho việc trao đổi chất của tinh trùng
• Tránh được sự kích thích của nhiệt độ
• Áp lực thẩm thấu phải bằng áp suất thẩm thấu của tinh dịch hoặc bằng nguyên sinh chất trong tinh trùng
• Có pH thích hợp với pH tinh dịch
• Giúp tinh trùng sống nhưng không vận động

Mỗi loài sẽ có những chất bảo quản phù hợp riêng. Ví dụ: 

• Tinh trùng cá mú nghệ (E. lanceolatus) được bảo quản tốt trong chất MPSR và TS-19
• Tinh trùng cá mú răng dài (E.bruneus) thì chất bảo quản thích hợp là Glucose 0,3M; 
• Tinh trùng cá mú sọc (E.septemfasciatus) thì có chất bảo quản phù hợp là ES1-3

Chất bảo quản có thể được pha với nước và giữ trong tủ lạnh trước khi sử dụng. Những loài khác nhau thì tỉ lệ pha loãng cũng khác nhau. Công thức của chất bảo quản có thể đơn giản hoặc phức tạp. 

Trong cùng một loài cá, nếu phương pháp bảo quản khác nhau thì chất bảo quản cũng khác nhau. Đối với thí nghiệm bảo tinh cá mú cọp trong tủ lạnh có nhiệt độ từ 0- 40C thì chất bảo quản phù hợp nhất là ASP (Artificial semina plasma). Theo nghiên cứu của Đặng Hoàng Trường (2014) thì “ tinh trùng bảo quản trong trong ASP có hoạt lực 4.00%, với vận tốc đạt 33.00 µm/s sống đến ngày thứ 24, trong khi đó, tinh trùng bảo quản trong 0.3 M Glucose, MPRS, BSA có hoạt lực và vận tốc lần lượt là 9.00%, 41.00 µm/s sống đến 21 ngày; 8%, 27.00 µm/s sống đến ngày thứ 15; và 4.00%, 28.00 µm/s sống đến ngày thứ 15”. Mặt khác, tinh cá mú cọp được bảo quản trong Nitơ lỏng thì chất bảo quản phù hợp lại là ES1-3 (Epinephelus septemfasciatus 1- 3), với kết quả hoạt lực là 71.56%, và vận tốc là 118.78 µm/s (cao nhất trong chín chất bảo quản còn lại gồm: ELRS3, ELS3, LG-ASP2, 150 Mm NaCl, 300 mM Glucose, DGS-1, DGS-2, MPRS) theo Phạm Văn Diễn (2017).

Chất chống đông

Chất chống đông (chất bảo vệ tế bào) là những hợp chất nhỏ có khả năng xâm nhập vào các tế bào tinh trùng. Chất chống đông được thêm vào chất bảo quản để hạn chế tối đa ảnh hưởng của sốc nhiệt, giúp tinh trùng sống lâu trong quá trình làm lạnh và rã đông. Ở nhiệt độ thấp, nguyên sinh chất của tinh trùng có hiện tượng bị kết lại và tế bào bị phá hủy, và tinh trùng có thể bị chết nếu trong dung dịch bảo quản không có chất chống đông. Nồng độ chất chống đông phải phù hợp thì tác dụng bảo vệ mới phát huy tốt nhất. Mỗi loài cá khác nhau thì có chất chống đông phù hợp khác nhau.

Trong một nghiên cứu của Phạm Văn Diễn năm 2017 đã tiến hành thí nghiệm bảo quản tinh trùng cá mú cọp trong 5 chất chống đông khác nhau gồm: DMA, DMSO (dimethyl sulfoxide), methanol, glycerol, ethylene glycol với 4 tỉ lệ khác nhau là 5%, 10%, 15%, 20%, ở Ni tơ lỏng. Kết quả cho thấy tinh trùng cá mú cọp được pha loãng ở tỉ lệ 1:3 trong ES1-3 cùng với 15% DMSO cho kết quả tốt nhất với hoạt lực là 82.56% và vận tốc là 136.89 µm/s. Kết quả thấp nhất được ghi nhận ở nghiệm thức tinh trùng bảo quản trong Methanol 20% với hoạt lực là 8.44 %, vận tốc tinh trùng là 68.89 µm/s. Và kết quả thí nghiệm cũng chỉ ra rằng hoạt lực và vận tốc của tinh trùng khi bảo quản trong chất chống đông có nồng độ từ 10-15 % cho kết quả cao hơn khi sử dụng ở nồng độ 5 và 20%. 

Tỉ lệ pha loãng 

Việc pha loãng giúp làm giảm mật độ tinh trùng, hạn chế các tác nhân gây hại ảnh hưởng đến chất lượng của tinh trùng. Tỉ lệ pha loãng giữa tinh và chất bảo quản ở các loài cá có thể thay đổi từ 1/1 đến 1/20. Khi tỉ lệ này lớn hơn 1/20 thì hoạt lực tinh trùng sau giải đông thường thấp. Trong điều kiện bảo quản bằng tủ lạnh, tỉ lệ pha loãng tinh cá mú cọp phù hợp nhất được tìm ra là 1:3. Với tỉ lệ này, tinh có hoạt lực là 4.56%, vận tốc là 12.33 µm/s và thời gian sống lên tới 21 ngày (Đặng Hoàng Trường, 2014). Còn trong điều kiện bảo tinh bằng Ni tơ lỏng thì kết quả nghiên cứu cũng tìm ra tỉ lệ pha loãng là 1:3. Theo nghiên cứu trên cho thấy tinh được bảo quản với tỉ lệ pha loãng này có hoạt lực là 83,6 % và vận tốc tinh trùng đạt 135,89 µm/s (Phạm Văn Diễn, 2017).

Nhiệt độ bảo quản

Nhiệt độ thấp có thể làm giảm sự phát triển của vi khuẩn, và giảm tỉ lệ trao đổi chất giúp kéo dài thời gian sống do tinh trùng ít tiêu hao năng lượng hoạt động. Nhiệt độ bảo quản lạnh tinh của những loài cá khác nhau thì khác nhau. Đối với những loài cá nhiệt đới thì nhiệt độ bảo quản tinh thường cao hơn nhiệt độ bảo tinh của những loài cá ôn đới. Theo nghiên cứu của Đặng Hoàng Trường năm 2014 đã chỉ ra nhiệt độ bảo quản tinh trùng cá mú cọp trong tủ lạnh tốt nhất là 40C. Kết quả cho thấy tinh trùng khi bảo quản ở nhiệt độ này cho hoạt lực là 10.00%, vận tốc là 54.00 µm/s và thời gian sống của tinh kéo dài đến 24 ngày. Mặc khác, tinh trùng cá mú cọp khi bảo quản trong ni tơ lỏng -196 0C lại cho thời gian bảo lâu hơn và chất lượng tinh cũng cao hơn.

Kháng sinh

Việc bổ sung kháng sinh khi bảo quản lạnh tinh trùng sẽ cải thiện được thời gian lưu giữ. Do ở nhiệt độ này một số loài vi khuẩn ưa lạnh vẫn còn hoạt động, chúng có thể sử dụng chất dinh dưỡng có trong tinh trùng để sinh trưởng, làm giảm chất lượng tinh. 

Năm 2014, Đặng Hoàng Trường và các cộng sự đã thử nghiệm ảnh hưởng của các loại kháng sinh với nồng độ khác nhau lên tinh trùng cá mú cọp, gồm: Neomycin, Gentamycin, và Penicillin kết hợp Streptomycin (mỗi nghiệm thức thử nghiệm tương ứng với 3 nồng độ: 200 ppm, 400 pmm, 600 pmm). Kết quả thu được cho thấy hoạt lực và vận tốc tinh trùng thấp nhất là ở nghiệm thức Penicillin kết hợp Streptomycin (nồng độ 200 ppm) với hoạt lực tinh trùng là 3.00%, vận tốc tinh trùng là 52 µm/s và thời gian sống của chúng kéo dài đến 30 ngày. Hai nghiệm thức còn lại cho kết quả tương đương nhau, cụ thể như sau: Với nghiệm thức bổ sung Neomycin 200 ppm cho hoạt lực và vận tốc tinh trùng lần lượt là: 4.00%, 56.00 µm/s thời gian sống của tinh là 36 ngày. Còn ở nghiệm thức Gentamycin 200 ppm cho kết quả hoạt lực là 9.00%, vận tốc tinh trùng là 63.00 µm/s thời gian sống của tinh là 30 ngày. Mặt khác, ở tất cả ba nghiệm thức trên nồng độ kháng sinh cho kết quả hoạt lực và vận tốc tốt nhất đều là 200 ppm, và thấp nhất là 600 ppm.

Quy trình làm lạnh (đối với bảo quản bằng Nitơ lỏng)

Trong quy trình làm lạnh thì tốc độ hạ nhiệt ảnh hưởng nhiều đến chất lượng tinh trùng sau khi rã đông. Tốc độ hạ nhiệt phải đủ chậm để nước trong các tế bào không bị đóng băng và nhanh chóng gia tăng nồng độ muối trong tế bào để không làm hỏng thành phần của chúng. 

Năm 2017, Phạm Văn Diễn đã thử nghiệm ảnh hưởng của quy trình làm lạnh đến hoạt lực và vận tốc tinh trùng như sau: nghiệm thức 1 (làm lạnh theo quy trình 1 bước): nhúng trực tiếp các mẫu chứa tinh trùng vào nitơ lỏng (-196^oC). Thử nghiệm 2 (làm lạnh theo quy trình 2 bước): đầu tiên hạ nhiệt xuống -76^oC trong vòng 5 phút,  rồi cho xuống nitơ lỏng. Quy trình 3 gồm 3 bước: hạ nhiệt xuống -20^oC trong 5 phút; sau đó hạ nhiệt xuống -76^oC trong 5 phút, cuối cùng đưa trực tiếp mẫu chứa tinh vào nitơ lỏng để bảo quản. Kết quả cho thấy hoạt lực và vận tốc tinh trùng đạt tối đa khi được làm lạnh theo quy trình 3 bước với hoạt lực đạt 84,11%, vận tốc tinh trùng đạt 136,56 µm/s (kết quả này không có sự khác biệt khi so sánh với quy trình làm lạnh 2 bước). Và kết quả thấp nhất thu được ở quy trình làm lạnh 1 bước, với hoạt lực là 40,11%, vận tốc 106,67 µm/s.

Trong hai cách bảo quản tinh trùng cá mú là bảo quản lạnh và bảo quản bằng ni tơ lỏng, thì tinh trùng được bảo quản trong ni tơ lỏng có chất lượng cao hơn và thời gian sống dài hơn tinh được bảo quản trong tủ lạnh. Ngoài ra chất lượng cá bố mẹ, mùa sinh sản cũng ảnh hưởng ít nhiều đến chất lượng tinh trùng. Và chưa có nghiên cứu đánh giá khả năng thụ tinh của tinh trùng sau khi bảo quản.