Sử dụng Bacillus để ức chế vi khuẩn Vibrio Harveyi gây bệnh trên tôm nuôi

Nghề nuôi tôm ở khu vực Đông Nam Á đang phát triển rất  nhanh chóng, trong đó có Việt Nam. Sản lượng cao nhất thuộc về tôm thẻ chân trắng, nên việc đầu tư cho các hệ thống nuôi ngày càng mở rộng và mang tính tích cực hơn. Tuy nhiên đi đôi với sự phát triển nhanh chóng đó là sự đe dọa lớn của dịch bệnh ngày một nghiêm trọng do vi khuẩn và virus gây ra. Do đó mà một lượng lớn kháng sinh đã được sử dụng và tồn dư.

Tuy nhiên hiện nay ngành nuôi tôm đang phát triển theo hướng an toàn, thân thiện với môi trường. Các kỹ thuật mới góp phần cải thiện năng suất mà không gây nguy hiểm cho tôm nuôi cũng như người sử dụng đang được áp dụng ngày càng nhiều. Một trong số đó là việc quản lý cộng đồng vi sinh vật trong các hệ thống nuôi trồng thủy sản, thông qua các chế phẩm sinh học được xem là một công cụ hỗ trợ phòng bệnh hiệu quả. Bổ sung vào thức ăn chủng vi sinh Bacillus đã được chứng minh là tăng cường các đáp ứng miễn dịch, giúp tăng trưởng nhanh, đồng thời cũng cải thiện chất lượng nước nuôi và cân bằng hệ vi sinh vật đường ruột ở cả tôm sú và tôm thẻ chân trắng.

Để có tác dụng cao với các hệ thống nuôi thủy sản, các chế phẩm sinh học phải tồn tại được trong các điều kiện môi trường sống không cân bằng như độ mặn, pH thay đổi, áp xuất thẩm thấu, oxy hòa tan thấp… Công nghệ vi bọc dạng viên nang cho thấy có thể bảo vệ được các chủng vi sinh đóng gói. Nghiên cứu này sẽ xác định lợi ích của chủng vi khuẩn Bacillus đối với giai đoạn postlarval trên tôm thẻ chân trắng và khả năng chống lại vi khuẩn V. harveyi của tôm.

Phương pháp và vật liệu

Nghiên cứu được thực hiện tại Thái Lan. Đầu tiên là thu thập giống giai đoạn postlarval tại một trại giống, sau đó tiến hành ương nuôi trong 15 ngày cho đến khi đạt cỡ PL30. Kiểm tra bằng các phương pháp khoa học để chứng minh giống tôm không mang mầm bệnh nhất là V.harveyi.

Các chủng vi khuẩn Bacillus (Bacillus thuringiensis, B. megaterium, B. licheniformis, B. polymyxa và B. subtilis) được phân lập từ ruột tôm sú qua quá trình nuôi cấy. Chuyển thành vi sinh Bacillus dạng khô và dạng vi bọc sao cho đúng với số lượng cần cho nghiên cứu và đảm bảo chỉ có một loại Bacillus thuần chủng trong mỗi mẫu chuẩn bị, duy trì khả năng sống của vi khuẩn đủ thời gian làm thí nghiệm.

Thả tôm PL30 với mật độ 52 con/m²  có sục khí ở mỗi bể (có tất cả 9 bể). Chăm sóc quản lý thật cẩn thận, theo dõi sức khỏe tôm hằng ngày để có những xử lý phù hợp khi bất thường xảy ra. Thí nghiệm bao gồm 3 nội dung: (a) là chế độ cho ăn bình thường để làm mẫu đối chứng (không có men vi sinh), (b) là chế độ cho ăn chứa Bacillus dạng đông khô (FB), (c) thêm vào nước nuôi chủng vi sinh Bacillus dạng vi bọc (MB). Trong trường hợp MB tôm được cho ăn bình thường và mỗi bể là một loài Bacillus khác nhau. Mỗi ngày bổ sung 3 lần để đảm bảo nồng độ cuối cùng là 10⁷ CFU/ml. 

Chuẩn bị mầm bệnh V. harveyi, xác định nồng độ gây chết LD50 theo một nghiên cứu trước đây là LD50 =1x10⁷ CFU/ml (theo Reed và Muench 1983).

Sau đó kiểm tra sự nhiễm trùng, các dấu hiệu của bệnh xảy ra, tỉ lệ sống, tỉ lệ tử vong của tôm thí nghiệm. Lấy mẫu từ tôm rồi nuôi cấy, phân lập vi khuẩn trên môi trường TCBS, sau đó xác định hình dạng và đặc điểm sinh hóa, giải trình tự gen của chúng. Đồng thời cũng lấy mẫu nước và phân rồi phân lập vi khuẩn trên các đĩa cấy. Chiết tách DNA của vi khuẩn, chạy PCR để khuếch đại các đoạn gen cần thiết cho nghiên cứu. Cuối cùng là phân tích thống kê để xác định hiệu quả của việc điều trị.

Kết quả

Sau 30 ngày cho ăn nhận thấy có sự tăng trọng lượng của nhóm FB và MB so với nhóm đối chứng. Tỷ lệ sống của nhóm đối chứng là 86,7% nhưng trong 2 nhóm FB và MB lên tới 96% và 95,3%. Tỷ lệ chết tích lũy ở nhóm đối chứng là 63,06%, trong 2 nhóm còn lại lần lượt là 43,24% và 45,05%. Một số biểu hiện được ghi nhận trên tôm thấy được là biếng ăn, lờ đờ trên mặt nước. Bên trong ruột trống và chứa nhiều chất nhầy, bị viêm sưng và xuất huyết, gan tụy tôm có màu xám và sưng phù.

Tỷ lệ Bacillus trong mẫu tôm rất cao trong 2 nhóm FB và MB, nhưng cả hai đều giảm mạnh sau khi nhiễm V. harveyi và duy trì ổn định sau đó. Bacillus chiếm ưu thế trong nhóm FB và MB, trong đó MB cao hơn so với FB. Sau thí nghiệm, tỉ lệ V. harveyi ở tôm trong 2 nhóm FB và MB thấp hơn rất nhiều so với nhóm đối chứng. Số lượng Bacillus tỉ lệ nghịch với số lượng V. harveyi đếm được trong các nhóm. Theo dõi các chỉ tiêu chất lượng nước cho thấy các điều kiện đều có thể chấp nhận được cho sự phát triển với tôm.

Thảo luận

Bacillus theo thức ăn và nguồn nước vào bề mặt niêm mạc ruột tôm, cạnh tranh chất dinh dưỡng và chỗ bám với các vi khuẩn gây bệnh. Bacillus được nghiên cứu là có khả năng sản xuất các enzyme ngoại bào giúp tăng cường khả năng tiêu hóa và hấp thu chất dinh dưỡng, nâng cao hiệu quả sử dụng thức ăn. Hơn nửa, Bacillus còn có khả năng sinh tổng hợp vitamin, coenzyme, các amino acid,.... Chúng hoạt động như một nguồn dinh dưỡng bổ sung trong đường ruột tôm. Mặc dù không có sự khác biệt về kết quả của phương pháp đông khô và vi bọc trong nghiên cứu này. Tuy nhiên việc sử dụng hình thức vi bọc phần nào ưu thế hơn trong việc cải thiện hiệu suất tăng trưởng và tỉ lệ sống của tôm.

Bacillus có khả năng sản xuất các chất ức chế dạng như kháng sinh đơn lẻ hay dạng kết hợp. Nghiên cứu trước  đây chứng minh Bacillus có tác dụng ức chế đối với V. parahaemolyticus và V. cholerea gây bệnh trong đường tiêu hóa của tôm sú. Sự bảo vệ trước tác hại của V. harveyi  của Bacillus đã được chứng minh có hiệu quả ở tôm sú, tôm càng xanh và một số loài khác. Quan sát được tôm sống sót có chỉ số thực bào cao hơn, hoạt động miễn dịch, hoạt động kháng khuẩn, số lượng tế bào máu cũng tăng lên đáng kể.

Vi sinh dạng vi bọc có khả năng bảo vệ vượt trội hơn dạng đông khô để chống lại v. harveyi gây bệnh ở tôm thẻ chân trắng. Mặc dù chưa rõ cơ chế họat động, nhưng những hiệu quả mang lại được thấy rõ là  giúp cân bằng hệ vi sinh trong đường ruột tôm, giảm tỉ lệ tử  vong khi nhiễm các bệnh do vibrio sp. gây ra. Đồng thời giúp tôm giảm bớt những tổn thương ở gan tụy và ruột.

Quorum Sensing là một phương tiện mà V. harveyi sử dụng để sản xuất độc lực của chúng là haemolysin. Tuy nhiên chủng Bacillus có khả năng cắt đứt các tín hiệu phát động để sản xuất ra độc lực này của vi khuẩn. Và vì thế một màng bảo vệ được hình thành bởi Bacillus, ngăn cản quá trình sản sinh độc lực của V.harveyi. Màng vi bọc có chứa Alginate là một chất kích thích miễn dịch đối với tôm. 

Một số loài Bacillus đã được chứng minh là có khả năng ngăn chặn sự tích tụ của các chất thải chứa nitơ (NH₃, NO₂…) thông qua các quá trình nitrat hóa hoặc khử nitơ hiếu khí, qua đó cải thiện chất lượng nước. Nghiên cứu này cũng chỉ ra rằng Bacillus đông khô và vi bọc là có hiệu quả tương đương nhau về mặt thúc đẩy sự tăng trưởng và cải thiện chất lượng nước, chống lại vi khuẩn V. harveyi. Tuy nhiên sự ổn định và tỉ lệ sống của Bacillus vi bọc cần được nghiên cứu thêm.