Kỹ thuật PCR trong thủy sản

PCR là gì?

PCR (polymerase chain reaction) là một kỹ thuật sinh học phân tử được sử dụng để "khuếch đại" phân tử DNA hoặc đoạn phân tử DNA ngoài cơ thể sống, làm tăng số lượng DNA ban đầu lên lượng tùy ý muốn theo cấp lũy thừa, tạo ra hàng ngàn đến  hàng triệu bản sao của một trình tự DNA nào đó.

Kỹ thuật PCR được phát triển vào năm 1983 bởi Kary Mullis, đây là một kỹ thuật phổ biến trong các phòng thí nghiệm nghiên cứu sinh học và y học. Việc xác định các bệnh di truyền cũng như bệnh truyền nhiễm, xác định huyết thống, giải trình tự DNA,... đều là những ứng dụng từ kỹ thuật PCR.

Khi quá trình PCR diễn ra, DNA mới được tạo ra từ DNA khuôn ban đầu sẽ tiếp tục được sử dụng làm khuôn để tổng hợp phân tử DNA tiếp  theo, tạo thành chuỗi phản ứng dây chuyền trong đó các mẫu DNA được khuếch đại theo cấp số nhân. Phương  pháp PCR dựa trên chu kỳ nhiệt. Có sử dụng Đoạn mồi (là đoạn DNA ngắn) mang các trình tự bổ sung với trình tự DNA đích.

Thành phần của PCR

PCR cần rất nhiều thành phần. Đó là: 

- DNA mẫu chứa mảnh DNA cần khuếch đại.

- Cặp mồi (primer): mang các trình tự bổ sung với trình tự DNA cần khuếch đại.

- DNA-polymerase enzyme: xúc tác cho việc nhân lên của DNA. 

- Nucleotides: là nguyên liệu cho DNA-polymerase để xây dựng DNA mới. 

- Dung dịch đệm, cung cấp môi trường thuận lợi cho DNA-polymerase.

Nguyên lý PCR

Bước 1: Biến tính. Dùng nhiệt phá vỡ cầu nối giữa 2 sợi DNA, tách DNA mạch đôi thành mạch đơn.

Bước 2: Gắn mồi. Gắn đoạn mồi vào sợi DNA đơn vừa được tách ra theo nguyên tắc bổ sung (nhiệt độ thấp).

Bước 3: Kéo dài. Enzyme DNA polymerase gắn tiếp vào sợi trống, xây dựng DNA mới.

Các loại PCR thường gặp?

RT-PCR (PCR phiên mã ngược): Là một kỹ thuật kết hợp giữa sao chép ngược (phiên mã ngược) RNA thành DNA (trong bối cảnh này được gọi là DNA bổ sung hoặc cDNA) và khuếch đại các mục tiêu DNA cụ thể bằng PCR. Nó chủ yếu được sử dụng để đo lượng RNA cụ thể, phân tích biểu hiện gen và định lượng RNA của virus trong các nghiên cứu và thực nghiệm lâm sàng.

Nested-PCR: Là kỹ thuật cải tiến của PCR với mục đích làm giảm sai lệch kết quả PCR trong trường hợp mồi không mong muốn gắn vào mạch DNA khi có tạp nhiễm. sử dụng 2 bộ mồi: Mồi 1 sẽ bắt cặp với DNA tổng hợp thành mạch mới. Mồi 2 sẽ bắt cặp với mạch mới vừa tổng hợp (sp PCR lần đầu) để tổng hợp mạch mới đúng như ý muốn. Kỹ thuật này sẽ xác định được sự hiện diện của mầm bệnh, dù số lượng rất nhỏ.

LAMP-PCR: Hoạt động dựa trên sự bắt cặp của 4 loại mồi vào 6 vị trí đặc hiệu trên gen đích. Kết quả là tạo thành hỗn hợp các sợi đôi DNA chứa nhiều trình tự DNA với mục tiêu và kích thước khác nhau. Phương pháp này khá đơn giản, rẻ tiền. Kết quả dương tính dựa trên phản ứng kết tủa với Mg-pyrophosphate sẽ phát quang dưới tia UV.

Real time PCR: Vừa khuếch đại số lượng DNA, vừa phát hiện và biết được mức độ bệnh (dựa vào số lượng DNA ít hay nhiều có trong mẫu). Phương pháp có sử dụng thuốc nhuộm huỳnh quang để xác định cường độ của chất đánh dấu, từ đó tính lượng hàm lượng DNA trong mẫu.

Multiplex PCR: Phản ứng tổng hợp một lúc nhiều mạch DNA của vật gây bệnh nhờ sử dụng nhiều cặp mồi, mỗi cặp mồi tương ứng với một đoạn gen đặc hiệu. Ưu điểm của phương pháp này là giảm thiểu được thời gian xác định bắt cặp vào mạch DNA chủ đích khi dùng 1 cặp mồi.

PCR trong thủy sản

Bất cứ vật nuôi nào cũng vậy, không chỉ riêng tôm cá, sẽ rất dễ mẫn cảm với mầm bệnh khi được mở rộng diện tích nuôi, ở những mật độ cao. Cho nên việc áp dụng kỹ thuật PCR vào chẩn đoán bệnh tôm là một phương pháp hiệu quả để kiểm soát, và quản lý dịch bệnh hiệu quả.

Nhiều bệnh trên tôm cá đã được chẩn đoán nhanh chóng bằng PCR:

Bệnh đốm trắng trên tôm(WSSV)

Bệnh hoại tử gan tụy cấp trên tôm (AHPND/EMS)

Bệnh vi bào tử trùng trên tôm (EHP)

Hội chứng Taura trên tôm (TSV)

Bệnh đầu vàng trên tôm (YHV)

Bệnh hoại tử cơ trên tôm (IMNV)

Bệnh hoại tử dưới vỏ và cơ quan tạo máu (IHHNV)

Bệnh Phát sáng trên tôm (Vibrio harveyi)

Vi khuẩn gây hoại tử gan tụy (NHPB)

Bệnh virus trên cá Koi: Koi Herpes Virus (KHV)

Bệnh vi khuẩn trên cá rô phi:  vi khuẩn Francisella-(FLB).