Phương pháp chẩn đoán bệnh EHP trên tôm

Enterocytozoon hepatopenaei (EHP), tác nhân gây bệnh gan tụy microsporidiosis, đã được báo cáo rộng rãi ở các nước nuôi tôm. Tôm nhiễm bệnh EHP thường đi kèm với nhiễm vi-rút hoặc vi khuẩn, bao gồm vi-rút hội chứng Taura, các chủng Vibrio parahaemolyticus liên quan đến bệnh hoại tử gan tụy cấp tính (VpAHPND) và hoại tử gan tụy do nhiễm trùng.

Việc phát hiện tôm nhiễm Enterocytozoon hepatopenaei (EHP) rất khó khăn vì không có dấu hiệu bệnh lý nào ngoại trừ dấu hiệu nghi ngờ có liên quan chậm lớn và hội chứng phân trắng (WFS). Cơ quan đích của EHP là gan tụy tôm, nhiễm trùng trong gan tụy làm suy giảm chuyển hóa thức ăn và cuối cùng dẫn đến chậm lớn. Nhiễm trùng EHP có thể truyền ngang qua đường miệng (ăn thịt) và có thể bằng truyền dọc (noãn).

Cho đến nay, không có vật chủ trung gian nào được biết là có liên quan đến bệnh này trên tôm. Kiến thức về bệnh EHP vẫn còn trong quá trình nghiên cứu để xác định dịch tễ học của bệnh, điều này rất có ý nghĩa trong vấn đề phòng và điều trị bệnh trên tôm.  

Hiện nay có nhiều phương pháp để chẩn đoán tôm nhiễm trùng EHP, chúng có thể được phát hiện bằng kính hiển vi quang học với các bào tử trên tiêu bản nhuộm kính phếch mô gan tụy hay mẫu phân. EHP có thể cũng được phát hiện bằng phản ứng chuỗi polymerase (PCR) nhắm vào gen tiểu đơn vị nhỏ (SSU) của RNA ribosome (rRNA) hoặc gen protein vách bào tử (SWP).

Cụ thể: 

Dấu hiệu lâm sàng 

Các dấu hiệu lâm sàng có thể nhìn thấy bên ngoài thường được sử dụng để chẩn đoán sơ bộ các trường hợp nghi ngờ nhiễm bệnh ở tôm. Tuy nhiên, trong trường hợp của EHP, các dấu hiệu nhìn thấy bên ngoài thường không có, ngoại trừ tôm chậm phát triển (chậm lớn) theo thời gian.

Theo ghi nhận một ao tôm nuôi bình thường tỷ lệ tôm chậm lớn chiếm 10% trở xuống, tuy nhiên ở ao tôm nhiễm EHP tỷ lệ này chiếm 30% hoặc nhiều hơn điều này dẫn đến vụ thu hoạch sẽ không có lãi.  

Nhuộm nhanh/mô bệnh học EHP  

Các đặc điểm mô bệnh học đặc trưng của nhiễm EHP bao gồm sự hiện diện của các giai đoạn sống của vi bào tử trùng trong các tế bào biểu mô ống gan tụy và bào tử tự do đã được giải phóng vào lumens ống gan tụy bị ly giải hoặc tế bào biểu mô bong tróc.

Những tính năng này có thể được quan sát bằng cách sử dụng tiêu chuẩn các phần mô được nhuộm hematoxylin và eosin (H&E) để tiết lộ sự hiện diện của các giai đoạn đầu ưa bazơ và bào tử ưa kiềm đến ưa bazơ hoặc bào tử khúc xạ trong tế bào chất của tế bào biểu mô ống gan tụy. điều này sẽ được quan sát thấy bởi kính hiển vi quang học ở 100X.

Tuy nhiên, điều này không dễ dàng phân biệt với tế bào vật chủ bình thường khi không có phương pháp nhuộm cụ thể, đặc biệt là trong nhiễm trùng ở mức độ thấp.  

Xét nghiệm lai tại chỗ (in situ hybridization-ISH) với tôm giống và tôm bố mẹ bị nhiễm EHP đã cho thấy những tín hiệu khả quan đối với EHP trong mô gan tụy.

Các đặc điểm mô bệnh học đặc trưng của nhiễm EHP

Tuy nhiên các dấu hiệu mô học của EHP có thể không thể kết luận được ngay cả với các nhà nghiên cứu bệnh học dày dạn kinh nghiệm. Do đó, khuyến cáo rằng một sự kết hợp của mô học và kỹ thuật phân tử được thực hiện song song để xác nhận sự hiện diện hay vắng mặt và mức độ nghiêm trọng của nhiễm trùng EHP.  

Kỹ thuật phân tử 

Hiện nay có nhiều phương pháp dựa trên PCR đã được mô tả để phát hiện EHP, bao gồm PCR một bước, PCR lồng nhau (Nested PCR) và PCR đa mồi có thể phát hiện EHP cùng với các mầm bệnh khác trên tôm.

Nhìn chung, PCR một bước đơn giản hơn để thực hiện và chỉ cần một bộ mồi, nhưng giới hạn phát hiện thường dao động từ 1000-10.000 bản sao cho mỗi phản ứng, không đủ nhạy để phát hiện nhiễm trùng ở trạng thái mang mầm bệnh. Nested PCR sử dụng hai bộ mồi khuếch đại gen mục tiêu, mang lại độ nhạy cao hơn ít nhất 10 lần so với một bước của nó và do đó mang lại khả năng phát hiện các trường hợp lây nhiễm ở mức độ thấp. PCR lồng được phát triển cho EHP có giới hạn phát hiện là 10 bản sao cho mỗi phản ứng. 

Mặc dù các phương pháp dựa trên PCR thường đủ cụ thể để xác định loài, nhưng việc giải thích sai có thể xảy ra nếu gen được chọn từ các loài mục tiêu thể hiện sự tương đồng cao với các loài từ các sinh vật có quan hệ gần gũi khác. Các gen SSU-rRNA đã được sử dụng rộng rãi làm PCR mục tiêu để xác định loài và chẩn đoán mầm bệnh vì trình tự thường đủ khác nhau giữa các loài khác nhau trong khi tương đối giống nhau trong cùng một loài. Vì lý do này, các chẩn đoán sớm dựa trên PCR được báo cáo cho EHP được thiết kế để nhắm mục tiêu vào gen SSUrRNA.

Tuy nhiên, một số báo cáo cho rằng trình tự giữa SSU-rRNA tương đồng cao từ microsporidian thủy sinh tại các vị trí ủ của mồi (nhận dạng 68–90%). Các mồi dựa trên gen SSU-rRNA từ EHP cho thấy phản ứng chéo đáng kể với các vi bào tử trùng thủy sinh có quan hệ gần gũi như Enterospora Cancer và Hepatospora eriocheir.

Do đó, mồi dựa trên trình tự SSU-rRNA có thể không phù hợp để kiểm tra phân tôm, thức ăn và nước nuôi. Thay cho gen SSU-rRNA, sử dụng protein vách bào tử (EhSWP1), gen mà trình tự của nó là duy nhất đối với EHP. Kỹ thuật PCR lồng (SWP-PCR) có thể phân biệt thành công EHP với các nhóm khác của microsporidian liên quan chặt chẽ trong khi hiển thị độ nhạy cao (10 bản sao cho mỗi phản ứng).

Để đảm bảo tính đặc hiệu, nên sử dụng gen EhSWP1 hoặc các gen khác có trình tự đa dạng cao giữa các vi bào tử trùng dưới nước được sử dụng, đặc biệt khi mục tiêu là phát hiện trong thức ăn, phân và mẫu môi trường. 

Phương pháp khuếch đại đẳng nhiệt (LAMP): LAMP có thể nhạy hơn 1000 lần so với PCR một bước. Để phát hiện EHP một nền tảng sử dụng LAMP kết hợp với nano vàng liên hợp thăm dò, phương pháp này có độ nhạy phát hiện EHP ở 0,02 fg (DNA tổng số) từ mô bị nhiễm bệnh, tương đương đến 1 bản sao EHP cho mỗi hỗn hợp phản ứng, nhạy hơn so với PCR lồng.  

Khuếch đại polymerase tái tổ hợp (RPA) là một kỹ thuật khuếch đại đẳng nhiệt có thể khuếch đại DNA ở nhiệt độ cố định trong khoảng từ 37 đến 42°C, với thời gian phản ứng ngắn nhất là 10 phút. Không giống như LAMP, RPA chỉ cần 1 cặp mồi và tạo ra một bộ khuếch đại duy nhất là tương thích với các quy trình xuôi dòng như nhân bản và trình tự Sanger đã phát triển kỹ thuật RPA dựa trên gen SSU-rRNA từ EHP với độ nhạy 800 bản sao cho mỗi phản ứng.

Khuếch đại polymerase tái tổ hợp (RPA)

PCR định lượng (qPCR) là một tiêu chuẩn vàng để định lượng mầm bệnh dựa trên mối tương quan tuyến tính giữa logarit của bản sao tiêu bản số lượng và số chu kỳ PCR cần thiết để đạt đến ngưỡng xác định trước. Để phát hiện EHP, các xét nghiệm qPCR dựa trên đầu dò huỳnh quang SYBR-Green I và TaqMan là có thể phát hiện ít nhất là 83 và 40 bản sao của ký sinh trùng, tương ứng. 

Như vậy, tôm giống nên được sàng lọc bằng PCR để xác nhận không có EHP trước khi thả giống và sau khi thả tôm giống âm tính với EHP, tôm trong ao nên được lấy mẫu định kỳ và xét nghiệm EHP bằng phương pháp phân tử. Nếu kết quả lấy mẫu ao định kỳ giúp phát hiện sớm EHP hoặc nếu HPM là nghi ngờ, quản lý ao có thể được thay đổi để giảm chiều ngang lây lan (ví dụ: giảm mật độ tôm, tăng cường thay nước, dọn phân, vớt và chôn tôm chết hoặc sắp chết để ngăn chặn ăn thịt nhau). Người nuôi nên tìm kiếm sự hỗ trợ của các chuyên gia kỹ thuật phù hợp để hỗ trợ theo dõi định kỳ bằng các công cụ chẩn đoán thích hợp và giải trình tự các công nghệ để phân biệt EHP với các EGM khác (và không phải EGM) microsporidian.