Multiplex PCR: Phát hiện nhanh, chính xác bệnh gan thận mủ

Hiện nay, cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) đang là một trong những đối tượng thủy sản được nuôi chủ lực ở nước ta. Việc mở rộng quy mô nuôi công nghiệp với tốc độ phát triển chóng mặt là một trong những nguyên nhân lây nhiễm ngày càng nhiều các bệnh gây ra do nấm Achya sp., bệnh nhiễm trùng máu do vi khuẩn Aeromonas hydrophila. Trong số đó, bệnh gan thận mủ do vi khuẩn Edwardsiella ictaluri gây ra tỷ lệ chết có thể lên đến 90-100%, tùy vào các quản lý và kích thước cá. Do không phát hiện kiểm thời và định lượng hóa chất và kháng sinh sử dụng chính xác dẫn đến phát sinh ra bệnh này đã xuất hiện hiện tượng kháng với thuốc kháng sinh điều trị như streptomycine, tetracycline. Vì vậy, nhu cầu cần thiết có các phương pháp phát hiện kịp thời bệnh gan thận mủ trên cá tra là rất cần thiết.

Việc định danh vi khuẩn E. ictaluri phần lớn sử dụng các phương pháp sinh hóa truyền thống. Do vi khuẩn phát triển trên môi trường nuôi cấy tổng hợp 48 giờ ở 28^oC nên phân lập, nuôi cấy, định danh kéo dài khoảng 4-7 ngày. Thời gian chuẩn đoán bệnh dài ngày nên thường không đáp ứng được nhu cầu đề xuất giải pháp trị bệnh cho các ao nuôi cá. Nên, phát triển phương pháp chẩn đoán nhanh và chính xác vi khuẩn này là rất cần thiết.

Gần đây, các nhà nghiên cứu tại Đại học Công nghiệp Thực phẩm Thành phố Hồ Chí Minh đã hoàn thành nghiên cứu “phát hiện vi khuẩn Edwardsiella ictaluri gây bệnh gan thận mủ trên cá tra (Pangasius hypophthalmus) bằng phương pháp Multiplex PCR” tạo điều kiện phát hiện nhanh bệnh gan thận mủ để có những can thiệp kịp thời nhằm giảm thiểu rủi ro mà bệnh mang lại. Đồng thời, tạo tiền đề để phát triển các bộ test kit nhanh đối với đối tượng nuôi cá tra với tác nhân gây bệnh là E. ictaluri.

Phương pháp Multiplex PCR phát hiện vi khuẩn E. ictaluri

Quy trình thực hiện: 

1. Thu nhận, tách chiết DNA genome của vi khuẩn E. ictaluri
2. Khảo sát động nhạy của các cặp mồi đặc hiệu
3. Phân lập và thu nhận mẫu cá tra nhiễm bệnh
4. Tiến hành thực hiện quy trình Multiplex PCR trên DNA tách chiết từ mẫu bệnh phẩm

Nguyên lý của Multiplex PCR:

Nguyên lí của Multiplex PCR (nguồn: http://www.premierbiosoft.com/)

Chỉ với một phản ứng PCR nhưng khuếch đại nhiều trình tự DNA (nhiều trình tự sẽ được khuếch đại cùng lúc sử dụng nhiều cặp mồi, tất cả các thành phần được bổ sung vào cùng một ống phản ứng). Do thực hiện nhiều phản ửng trong một ống nên việc thiết kế mồi đặc hiệu là vô cùng quan trọng vì để tránh trường hợp các cặp mồi bắt cặp chéo với nhau tạo thành các dimer primer dẫn đến việc khuếch đại không đặc hiệu. Có thể thiết kế mồi bằng phần mềm PrimerPlex cho phản ứng multiplex PCR.

Ở nghiên cứu trên, các nhà nghiên cứu đã sử dụng 3 cặp mồi khuếch đại tương ứng cho 3 gen trên cá tra là:

Sau khi khảo sát các cặp mồi đặc hiệu thì cặp mồi FserC/RserC và EiFd/EiRs được chọn để tiến hành Multiplex PCR. Kết quả thu được khi tiến hành trên 20 mẫu DNA được tách chiết từ mẫu bệnh phẩm.

Đối chứng dương là giếng 21, đối chứng âm là giếng 22, M: DNA marker. Giếng số 5,6 không xuất hiện vậy suy ra mẫu này âm tính. Trong khi mẫu 2,4 và 16 chỉ xuất hiện một đường của vạch 191 bp cho cặp mồi FserC/RserC. Chứng tỏ các giếng này dương tính với E. ictaluri. Như vậy, khi thử nghiệm phản ứng PCR đa mồi trên tổng số 20 mẫu cá thử nghiệm thì có 90% số mẫu dương tính với E. ictaluri và 10% số mẫu là âm tính. 

Như chúng ta đã thấy, nếu chỉ dùng PCR truyền thống với 1 cặp mồi thì khả năng xuất hiện âm tính giả rất cao trong mẫu kiểm tra, nhờ vào multiplex PCR mà đã độ nhạy của phản ứng đã được nâng lên giúp kiểm tra phát hiện vi khuẩn chính xác hơn. Ngoài ra, để hoàn thiện hơn cho phản ứng thì các nhà nghiên cứu nên sử dụng thêm chứng nội (internal control) để đảm bảo gần quá trình thực hiện của các phản ứng không xảy ra sai sót để đảm bảo tính chính xác hơn nữa.

Tóm lại, với 2 cặp mồi FserC/RserC và EiFd/EiRs đặc hiệu, phản ứng PCR đa mồi giúp phát hiện vi khuẩn Edwardsiella ictaluri gây bệnh gan thận mủ trên cá tra. Trong tổng số 20 mẫu cá tra thu thập tại tỉnh Đồng Tháp, tỉ lệ nhiễm bệnh là 90%. Nồng độ DNA khuôn mẫu được sử dụng để phát hiện tác nhân gây bệnh là 20ng/µL. Việc sử dụng PCR đa mồi sẽ giúp khắc phục hiện tượng âm tính giả hay dương tính giả so với PCR đơn mồi. Nghiên cứu này cũng tạo tiền đề cho sản xuất bộ kit PCR phát hiện nhanh vi khuẩn Edwardsiella ictaluri là tác nhân gây bệnh trên đối tượng thủy hải sản.

Bài viết dùng thông tin tổng hợp từ nhiều nguồn.