Phát hiện nhanh EHP trên tôm thẻ bằng xét nghiệm RT-RPA

Chúng là một loại ký sinh trùng, phá hủy các tế bào biểu mô hình ống ở gan tụy, cản trở quá trình hấp thụ chất dinh dưỡng của tôm, dấu hiệu điển hình của bệnh là tôm sinh trưởng chậm, còi cọc, mềm vỏ và các triệu chứng phân trắng. Ở các nước châu Á như Ấn Độ, Thái Lan và Trung Quốc ghi nhận được bệnh EHP gây giảm 10% –20% sản lượng tôm hàng năm, dẫn đến thiệt hại đáng kể về kinh tế. EHP được báo cáo lần đầu tiên vào năm 2009 ở Thái Lan. 

Bệnh EHP không có triệu chứng hay bất cứ dấu hiệu lâm sàng cụ thể. Vì vậy việc xét nghiệm chuẩn đoán được xem làm phương pháp hiệu quả nhất. Có nhiều cách phát hiện EHP trên tôm thông qua xét nghiệp PCR truyền thống, qPCR (PCR định lượng) hoặc LAMP. Tất cả các loại xét nghiệm trên đều có một kỹ thuật chung là khuếch đại DNA từ mẫu bệnh và hiện nay được sử dụng rất phổ biến để xác định các loại bệnh do vi sinh vật gây ra. Tuy nhiên, các phương pháp này đòi hỏi kỹ thuật cao, thiết bị tiên tiến, chi phí xét nghiệm đắt đỏ và cần nhiều thời gian. Mặc dù phương pháp LAMP chỉ mất 45 phút cho phản ứng, nhưng nó vẫn yêu cầu một máy điều khiển nhiệt độ tiên tiến với độ chính xác cao. 

Bào tử EHP trong (A) phết tế bào HP đã nhuộm và (B) một phần mô HP đã nhuộm. Ảnh semanticscholar

Gần đây, kỹ thuật RPA (recombinase polymerase amplification) bản chất là khuếch đại acid nucleic (bao gồm cả ADN và ARN) dựa vào hoạt tính của enzyme tái tổ hợp (enzyme recombinase) và polymerase (enzyme tổng hợp chuỗi polyme hoặc axit nucleic), đã được ứng dụng và đánh giá là có tiềm năng lớn trong nghiên cứu chẩn đoán bệnh ký sinh trùng và virus. Điểm mấu chốt quan trọng của kỹ thuật RPA là việc sử sụng enzyme tái tổ hợp và phân tử SSB để thay thế cho bước biến tính (DNA khuôn mẫu được tách thành 2 sợi đơn) trong PCR truyền thống.Vì thế, RPA cho phép khuếch đại đẳng nhiệt (hay khuếch đại ở nhiệt độ cố định) ở 37-42ºC và thời gian để xác định mẫu chỉ khoảng 5-20 phút.  Phân tử SSB (Single stranded binding protein) bao gồm các phân tử protein giúp hai mạch đơn của DNA không bị dính vào nhau sau khi tách thành 2 sợi để các enzyme có thể hoạt động). 

Được biết một chu kỳ nhiệt của xét nghiệm PCR gồm 3 giai đoạn: giai đoạn biến tính, nhiệt độ được nâng lên đến 94ºC để mạch đôi DNA có thể tháo xoắn; giai đoạn tiếp theo là giai đoạn bắt cặp, nhiệt độ sẽ được hạ xuống khoảng 55 ºC - 65 ºC để các đoạn mồi sẽ tiến hành bắt cặp bổ sung ; và cuối cùng là giai đoạn kéo dài, nhiệt độ lúc này cần đạt 72 ºC để Tag enzyme hoạt động và gắn kết thành một mạch bổ sung hoàn chỉnh. Chu kỳ này lặp lại khoảng 25 - 40 lần tùy vào từng loại phản ứng.

Các nhà nghiên cứu đã cố gắng áp dụng công nghệ RPA để phát hiện bệnh EHP trên tôm và đã đơn giản hóa quy trình không cần đến máy đo nhiệt độ. Tuy nhiên, việc phân tích các sản phẩm khuếch đại bằng điện di trên gel chỉ cho phép thực hiện tại phòng thí nghiệm, khó ứng dụng tại các trại thực tế, và độ nhạy cũng bị hạn chế bởi các công cụ hình ảnh gel.

Nghiên cứu gần đây ứng dụng phương pháp đọc tín hiệu huỳnh quang và xét nghiệm RT-RPA (RPA thời gian thực) để phát hiện bệnh EHP ở tôm. Thử nghiệm sử dụng gen SWP để mã hóa protein thành bào tử của EHP. Gen này được chẩn đoán là phân tử tốt hơn so với gen SSU rARN. Các kết quả trong nghiên cứu trước đây cũng đã xác nhận tính đặc hiệu tốt của gen này đối với việc phát hiện EHP.

Xét nghiệm RT- RPA cho thấy độ nhạy tốt và có thể so sánh với phương pháp PCR lồng (nested PCR – phương pháp sử dụng sản phẩm của phản ứng PCR lần 1 sẽ làm khuôn cho phản ứng PCR lần 2. Độ nhạy và độ đặc hiệu của kỹ thuật được đánh giá rất cao) và tốt hơn nhiều so với xét nghiệm RPA sử dụng phân tích điện di trên gel. So sánh với xét nghiệm RPA sử dụng phân tích điện di trên gel, độ nhạy của RT- RPA đã được cải thiện gần 60 lần. Hơn nữa, kết quả RT- RPA của các mẫu cho kết quả tương đồng 100% với phương pháp PCR lồng, cho thấy độ tin cậy tốt.

Khi đầu dò huỳnh quang được sử dụng, kết quả có thể được xác nhận bằng hình ảnh hóa ngay sau 15 phút. Những máy quét ống huỳnh quang kích thước nhỏ, chạy bằng pin có thể sử dụng để làm tín hiệu cho xét nghiệm RT-RPA tại chỗ. Do ít phụ thuộc vào thiết bị và nguồn điện, RT- RPA có thể dễ dàng lắp ráp thành phòng thí nghiệm vali di động, thuận tiện mang theo.

RPA đã được áp dụng chuẩn đoán các mầm bệnh do virus, chẳng hạn như WSSV (bệnh đốm trắng trên tôm), IHHNV (bệnh hoại tử cơ quan tạo máu và cơ quan lập biểu mô trên tôm), và SHIV (Shrimp hemocyte iridescent virus - Virus mới phát hiện gây tỉ lệ chết cao trên tôm thẻ chân trắng).

Một thử nghiệm RT- RPA kết hợp đọc tín hiệu bằng đầu dò huỳnh quang có thể phát hiện nhanh chóng sự lây nhiễm EHP ở tôm. Nó có thể được áp dụng như một công cụ phát hiện tại chỗ hiệu quả và đáng tin cậy để giúp kiểm soát sự lây nhiễm EHP trong các trang trại nuôi tôm.