Phát hiện nhanh EHP trên tôm thẻ bằng xét nghiệm RT-RPA

EHP (Enterocytozoon hepatopenaei) hay còn gọi là bệnh chậm lớn trên tôm do vi bào tử trùng gây ra.

Tôm thẻ chân trắng
EHP (Enterocytozoon hepatopenaei) là loại bệnh trên tôm gây ra bệnh chậm lớn trên tôm thẻ, kèm theo phân trắng trên tôm. Ảnh themarketherald.com.au

Chúng là một loại ký sinh trùng, phá hủy các tế bào biểu mô hình ống ở gan tụy, cản trở quá trình hấp thụ chất dinh dưỡng của tôm, dấu hiệu điển hình của bệnh là tôm sinh trưởng chậm, còi cọc, mềm vỏ và các triệu chứng phân trắng. Ở các nước châu Á như Ấn Độ, Thái Lan và Trung Quốc ghi nhận được bệnh EHP gây giảm 10% –20% sản lượng tôm hàng năm, dẫn đến thiệt hại đáng kể về kinh tế. EHP được báo cáo lần đầu tiên vào năm 2009 ở Thái Lan. 

Bệnh EHP không có triệu chứng hay bất cứ dấu hiệu lâm sàng cụ thể. Vì vậy việc xét nghiệm chuẩn đoán được xem làm phương pháp hiệu quả nhất. Có nhiều cách phát hiện EHP trên tôm thông qua xét nghiệp PCR truyền thống, qPCR (PCR định lượng) hoặc LAMP. Tất cả các loại xét nghiệm trên đều có một kỹ thuật chung là khuếch đại DNA từ mẫu bệnh và hiện nay được sử dụng rất phổ biến để xác định các loại bệnh do vi sinh vật gây ra. Tuy nhiên, các phương pháp này đòi hỏi kỹ thuật cao, thiết bị tiên tiến, chi phí xét nghiệm đắt đỏ và cần nhiều thời gian. Mặc dù phương pháp LAMP chỉ mất 45 phút cho phản ứng, nhưng nó vẫn yêu cầu một máy điều khiển nhiệt độ tiên tiến với độ chính xác cao. 

EHP
Bào tử EHP trong (A) phết tế bào HP đã nhuộm và (B) một phần mô HP đã nhuộm. Ảnh semanticscholar

Gần đây, kỹ thuật RPA (recombinase polymerase amplification) bản chất là khuếch đại acid nucleic (bao gồm cả ADN và ARN) dựa vào hoạt tính của enzyme tái tổ hợp (enzyme recombinase) và polymerase (enzyme tổng hợp chuỗi polyme hoặc axit nucleic), đã được ứng dụng và đánh giá là có tiềm năng lớn trong nghiên cứu chẩn đoán bệnh ký sinh trùng và virus. Điểm mấu chốt quan trọng của kỹ thuật RPA là việc sử sụng enzyme tái tổ hợp và phân tử SSB để thay thế cho bước biến tính (DNA khuôn mẫu được tách thành 2 sợi đơn) trong PCR truyền thống.Vì thế, RPA cho phép khuếch đại đẳng nhiệt (hay khuếch đại ở nhiệt độ cố định) ở 37-42ºC và thời gian để xác định mẫu chỉ khoảng 5-20 phút.  Phân tử SSB (Single stranded binding protein) bao gồm các phân tử protein giúp hai mạch đơn của DNA không bị dính vào nhau sau khi tách thành 2 sợi để các enzyme có thể hoạt động). 

Được biết một chu kỳ nhiệt của xét nghiệm PCR gồm 3 giai đoạn: giai đoạn biến tính, nhiệt độ được nâng lên đến 94ºC để mạch đôi DNA có thể tháo xoắn; giai đoạn tiếp theo là giai đoạn bắt cặp, nhiệt độ sẽ được hạ xuống khoảng 55 ºC - 65 ºC để các đoạn mồi sẽ tiến hành bắt cặp bổ sung ; và cuối cùng là giai đoạn kéo dài, nhiệt độ lúc này cần đạt 72 ºC để Tag enzyme hoạt động và gắn kết thành một mạch bổ sung hoàn chỉnh. Chu kỳ này lặp lại khoảng 25 - 40 lần tùy vào từng loại phản ứng.

Các nhà nghiên cứu đã cố gắng áp dụng công nghệ RPA để phát hiện bệnh EHP trên tôm và đã đơn giản hóa quy trình không cần đến máy đo nhiệt độ. Tuy nhiên, việc phân tích các sản phẩm khuếch đại bằng điện di trên gel chỉ cho phép thực hiện tại phòng thí nghiệm, khó ứng dụng tại các trại thực tế, và độ nhạy cũng bị hạn chế bởi các công cụ hình ảnh gel.

Nghiên cứu gần đây ứng dụng phương pháp đọc tín hiệu huỳnh quang và xét nghiệm RT-RPA (RPA thời gian thực) để phát hiện bệnh EHP ở tôm. Thử nghiệm sử dụng gen SWP để mã hóa protein thành bào tử của EHP. Gen này được chẩn đoán là phân tử tốt hơn so với gen SSU rARN. Các kết quả trong nghiên cứu trước đây cũng đã xác nhận tính đặc hiệu tốt của gen này đối với việc phát hiện EHP.

Xét nghiệm RT- RPA cho thấy độ nhạy tốt và có thể so sánh với phương pháp PCR lồng (nested PCR – phương pháp sử dụng sản phẩm của phản ứng PCR lần 1 sẽ làm khuôn cho phản ứng PCR lần 2. Độ nhạy và độ đặc hiệu của kỹ thuật được đánh giá rất cao) và tốt hơn nhiều so với xét nghiệm RPA sử dụng phân tích điện di trên gel. So sánh với xét nghiệm RPA sử dụng phân tích điện di trên gel, độ nhạy của RT- RPA đã được cải thiện gần 60 lần. Hơn nữa, kết quả RT- RPA của các mẫu cho kết quả tương đồng 100% với phương pháp PCR lồng, cho thấy độ tin cậy tốt.

Khi đầu dò huỳnh quang được sử dụng, kết quả có thể được xác nhận bằng hình ảnh hóa ngay sau 15 phút. Những máy quét ống huỳnh quang kích thước nhỏ, chạy bằng pin có thể sử dụng để làm tín hiệu cho xét nghiệm RT-RPA tại chỗ. Do ít phụ thuộc vào thiết bị và nguồn điện, RT- RPA có thể dễ dàng lắp ráp thành phòng thí nghiệm vali di động, thuận tiện mang theo.

RPA đã được áp dụng chuẩn đoán các mầm bệnh do virus, chẳng hạn như WSSV (bệnh đốm trắng trên tôm), IHHNV (bệnh hoại tử cơ quan tạo máu và cơ quan lập biểu mô trên tôm), và SHIV (Shrimp hemocyte iridescent virus - Virus mới phát hiện gây tỉ lệ chết cao trên tôm thẻ chân trắng).

Một thử nghiệm RT- RPA kết hợp đọc tín hiệu bằng đầu dò huỳnh quang có thể phát hiện nhanh chóng sự lây nhiễm EHP ở tôm. Nó có thể được áp dụng như một công cụ phát hiện tại chỗ hiệu quả và đáng tin cậy để giúp kiểm soát sự lây nhiễm EHP trong các trang trại nuôi tôm.

Tổng hợp
Đăng ngày 10/02/2022
Ngọc Diễm @ngoc-diem
Dịch bệnh

Làm sao để nhận biết tôm thẻ bị bệnh gan?

Trong số các vấn đề sức khỏe mà tôm thường gặp phải, bệnh gan là một trong những vấn đề phổ biến và có thể gây tổn thất lớn đối với nuôi tôm. Tuy nhiên, việc nhận biết triệu chứng của bệnh gan ở tôm có thể không phải là một nhiệm vụ dễ dàng.

Tôm vàng gan
• 09:33 24/05/2024

Tại sao điều trị bệnh trên tôm lại kém hiệu quả?

Việc trị bệnh trong ngành nuôi tôm luôn là một thách thức không nhỏ đối với những người làm trong lĩnh vực này.

Tôm bệnh
• 09:52 10/05/2024

Tình hình tôm chết sớm nghi bệnh mờ đục trên ấu trùng tôm thẻ (TPD)

Theo ghi nhận từ Sở Nông nghiệp và PTNT về việc rà soát, nắm thông tin tình hình tôm nuôi chết sớm nghi do bệnh TPD và triển khai các biện pháp phòng, chống dịch bệnh.

Tôm thẻ
• 10:30 06/05/2024

Xổ ký sinh trùng có ảnh hưởng đường ruột tôm?

Tôm bị ký sinh trùng đường ruột là một vấn đề thường xảy ra ở các ao nuôi tôm, gây ảnh hưởng đến sức khỏe, trưởng thành và năng suất của vụ nuôi.

Đường ruột tôm
• 10:42 08/04/2024

Điểm khó của nuôi biển

Nuôi biển hiện nay gặp nhiều rào cản cho sự phát triển, bao gồm các yếu tố nội tại mỗi cá nhân, doanh nghiệp, hợp tác xã về sự dám làm, dám chinh phục mặt nước biển để nuôi trồng thủy sản đến các rào cản từ thiên nhiên khắc nghiệt, rào cản từ chính sách, pháp luật.

Nuôi biển
• 19:29 24/05/2024

Ưu và nhược điểm các loại nước nuôi tôm

Nuôi tôm là ngành nghề đã dần phổ biến cho người dân tại Việt Nam. Tuy nhiên, tại mỗi khu vực sẽ có chất lượng nước ao nuôi khác nhau. Mặc dù loại nước nào cũng có thể nuôi tôm nếu biết kiểm soát tốt các yếu tố môi trường, nhưng để làm rõ hơn về ưu và nhược điểm từng loại qua bài viết dưới đây cho mọi người cùng tham khảo!

Tôm thẻ chân trắng
• 19:29 24/05/2024

Xuất khẩu cá ngừ sang thị trường Nga

Sau một giai đoạn trì trệ do ảnh hưởng của cuộc xung đội Nga – Ukraine, xuất khẩu cá ngừ của Việt Nam sang Nga đã phục hồi và có xu hướng ngày càng tăng. Kim ngạch xuất khẩu cá ngừ sang thị trường này đã tăng gấp đôi chỉ sau 3 năm.

Cá ngừ
• 19:29 24/05/2024

Tập hợp ngạnh các loài cá có độc bạn cần để ý

Trong tự nhiên, luôn tồn tại một số loài cá mà ngạnh của chúng chứa nọc độc, gây ra nỗi khiếp sợ cho con người. Sau đây, bài viết sẽ tập hợp ngạnh các loài cá có độc để các bạn để ý, có biện pháp an toàn khi sờ vào nhé!.

Cá có ngạnh độc
• 19:29 24/05/2024

Làm sao để nhận biết tôm thẻ bị bệnh gan?

Trong số các vấn đề sức khỏe mà tôm thường gặp phải, bệnh gan là một trong những vấn đề phổ biến và có thể gây tổn thất lớn đối với nuôi tôm. Tuy nhiên, việc nhận biết triệu chứng của bệnh gan ở tôm có thể không phải là một nhiệm vụ dễ dàng.

Tôm vàng gan
• 19:29 24/05/2024