Hội chứng chết đỏ ở tôm he chân trắng (Litopenaeus vannamei)

Hình 1. Các dấu hiệu chính ở tôm chân trắng bị hội chúng chết đỏ a. Tôm bệnh thể hiện sự chuyển màu hồng đỏ toàn thân, ruột có ít thức ăn; b. Tôm bệnh nặng chuyển màu đỏ bầm; c. Mặt dưới giáp đầu ngực của một số tôm bị hội chứng chết đỏ tồn tại các đốm trắng có kích thước 0,5 - 2 mm.

2. Địa điểm nghiên cứu

Mẫu tôm bị hội chứng chết đỏ và tôm khỏe đã được thu từ các ao nuôi tôm chân trắng thương phẩm tại Khánh Hòa và Ninh Thuận. Phân lập vi khuẩn và phương pháp mô bệnh học từ tôm bệnh được thực hiện ở phòng thí nghiệm thuộc Khoa Nuôi trồng thủy sản, Đại học Nha Trang. Kỹ thuật PCR (polymerase chain reaction) đã được thực hiện tại Phòng công nghệ sinh học - viện CNSH & MT – Trường Đại học Nha Trang. Kỹ thuật RT-PCR (Reverse Transcription-PCR) đã thực hiện tại Phòng sinh học phân tử, Viện Nghiên cứu NTTS II. Kỹ thuật kính hiển vi tử (Transmisslon Electron Microscopy-TEM) đã thực hiện ở Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương. Thí nghiệm cảm nhiễm vào tôm khỏe đa được thực hiện ở một trại giống ở phường Vĩnh Hòa, thành phố Nha Trang.

3. Kết quả nghiên cứu và thảo luận:
3.1 Các dấu hiệu chính của hội chứng chết đỏ ở tôm chân trắng:

Bảng 1: Tần suất gặp các dấu hiệu bệnh ở tôm chân trắng bị hội chứng chết đỏ

Từ 30 mẫu tôm chân trắng bị hội chứng chết đỏ, các dấu hiệu chính các mẫu này đều thể hiện dấu hiệu đầu tiên là cơ thể tôm chuyển sang màu hồng đỏ và đỏ bầm khi bệnh nặng tôm bệnh bỏ ăn với ruột rỗng hoặc có ít thực ăn. Tôm bệnh bơi lờ đờ ở tầng nước mặt hoặc tấp vào bờ ao và chết. Ngoài ra, có 10 mẫu tôm bênh (33,3%) thể hiện dấu hiệu đỏ thân kèm theo các đốm trắng (0,5-2,0 mm dưới giáp đầu ngực, tương tự như dấu hiệu của hội chứng đốm trắng (WSS) ở tôm sú (Penaeus monodon) đã được thông báo bởi Lightner (l996), Đỗ Thị Hòa (2004) và Flegel (2006). (Bảng 1 và hình 1).

3.2 Kết quả phân tích PCR, RT-PCR và mô bệnh học của các mẫu tôm bị hội chứng chết đỏ

Đã có nhiều nghiên cứu về tác hại của virus WSSV và TSV ở tôm chân trắng  (Litopenaeus vannamei) và một trong các dấu hiệu đã biết của 2 bệnh này là làm cơ thể tôm bệnh chuyển màu đỏ ở đuôi và phần phụ do nhiễm TSV (Chuchird, 2005 và Flegel, 2006), hay chuyển màu đỏ toàn bộ cơ thể tôm do WSSV (Lightner, 1 996; Wongteerasupaya, 2010 và Afshamasab, 2009). Do vậy, kỹ thuật PCR và RT-PCR đã được dùng để xác định tỷ lệ nhiễm virus TSV và WSSV ở các mẫu tôm bị chết đỏ. Bên cạnh đó, phương pháp mô bệnh học được dùng để xác định những biến đổi bệnh lý trong mô và tê bào của các cơ quan ở tôm bệnh nhằm hỗ trợ chẩn đoán tác nhân gây bệnh. Kết quả được trình bày ở bảng 2 và hình 2.

Bảng 2: Tỷ lệ nhiễm WSSV và TSV của các mẫu tôm chân trắng bị hội chứng chết đỏ

Hình 2. Biến đổi mô bệnh học của tôm bị hội chứng chết đỏ

a. Các thể vùi của WSSV tồn tại trong nhân tế bào ở biểu mô vỏ của tôm bệnh
b. Các thể vùi của WSSV tồn tại ở trong nhân của tế bào biểu mô dạ dày của tôm bệnh. (Nhuộm H & E, 400X).

Kết quả ở bảng 2 đã thể hiện rằng, các mẫu tôm bị hội chứng chết đỏ đã bị nhiễm WSSV với tỷ lệ rất cao (27/30 chiếm 90% khi phân tích mẫu bệnh bằng kỹ thuật PCR ở cả nhóm mẫu tôm bệnh chỉ bộc lộ dấu hiệu đỏ thân (20 mẫu) và nhóm mẫu tôm bệnh biểu hiện cả đỏ thân và đốm trắng (10 mẫu). Phân tích mô bệnh học đã chỉ ra rằng, các biến đổi bệnh lý trong mô và tế bào đặc trưng cho sự nhiễm WSSV đã được quan sát thấy ở các cơ quan đích như: mang, dạ dày, biểu mô dưới vỏ…của 100 mẫu tôm bị chết đỏ (n=30) tương tự như các thông báo về mô bệnh học của hội chứng đốm trắng tôm he (Lightner, 1996, Afsharnasab, 2009). Có 3/30 mẫu tôm (10%) bị nhiễm hội chứng chết đỏ lại có kết quả âm tính với WSSV khi phân tích bằng kỹ thuật PCR nhưng đã bộc lộ bệnh lý của hội  chứng đốm trắng (WSS) trong mô và tế bào của cơ quan đích (hình 2). Hiện tượng âm tính giả của 3 mẫu tôm bệnh với WSSV có thê liên quan tới việc sai số chủ quan trong chuẩn đoán bằng kỹ thuật PCR. Ngoài ra phân tích bằng kỹ thuật RT-PCR cũng đã chỉ ra rằng, 30 mẫu tôm bị hội chứng chết đỏ hoàn toàn không bị nhiễm virus gây hội chứng Taura (TSV). Trong khi đó toàn bộ các mẫu tôm khỏe (14 mẫu) đã có kết quả âm tính với WSSV và TSV.

3.3 Quan sát và phát hiện virus hình que dạng WSSV trong mô của tôm bệnh dưới kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM)

Dưới kính hiển vi điện tử xuyên qua (TEM) một loại virus có dạng hình que, có vỏ bao, kích thước từ 133-164 x 296-383 nm đã được phát hiện trong mô mang cua tôm bi hội chứng chết đỏ và các vi thể của virus này tập trung thành từng đám và chiếm chỗ trong nhân của tế bào, làm chất nhân tập trung đậm đặc ở sát màng nhân (hình 3).

Kích thước các vi thể virus đã phải hiện được trong mô của tôm chân trăng bị chết đỏ trong nghiên cứu này tương đương với thông số về kích thước của WSSV gây bệnh ở tôm he đã từng được công bố bởi Lightner (1996): 70-150 x 350-380 nm nhưng lại lớn hơn so với công bố của Wongteerasupaya (2010): 121-276 nm.

Hình 3. Virus hình que có vỏ, kích thước 133-164 x 296-383 nm: đã phát hiện trong nhân của tế bào biểu mô ở mang tôm chân trắng bị hội chứng chết đỏ (Hình chụp dưới TEM độ phóng đại là 5000 X và 8000X)

3.4 Vi khuẩn đã phân lập từ mẫu tôm bị hội chứng chết đỏ

Đã có 40 chủng vi khuẩn được phân lập ở nhiệt độ 28-30^oC từ gan tụy và máu của các mẫu tôm bị hội chứng chết đỏ và từ các mẫu tôm khỏe, trong đó có 15 loài vi khuẩn đã được định danh. Tần suất bắt gặp của các loài vi khuẩn này thấp ở cả 2 nhóm tôm bệnh (từ 8,33 – 25%) và tôm khỏe (25-50%). Điều này đã cho thấy, vi khuẩn không có khả năng là tác nhân chính gây hội chứng chết đỏ ở tôm chân trắng, tuy nhiên có một số loài vi khuẩn chi phân lập được nhóm tôm bệnh, mà không gặp ở nhóm tôm khỏe như: Staphylococcus sp1, Vibrio parahaemolyticus, V. vulnificus, V. alginolyticus, mặc dù tần số gặp rất thấp. Do vậy, một số chủng vi khuẩn cũng được dùng để cảm nhiễm vào tôm khỏe nhằm đánh giá vai trò của vi khuẩn trong hội chứng chết đỏ ở tôm chân trắng.

3.5. Xác định tác nhân chính gây ra hội chứng chết đỏ ở tôm chân trắng (L. vannamei)

Để xác định tác nhân chính gây ra hội chứng chết đỏ ở tôm chân trắng thí nghiệm cảm nhiễm dịch lọc từ tôm bệnh trong Phosphate Buffer Saline (PBS) qua màng 0,2  µm cảm nhiễm các huyễn dịch của các chủng vi khuẩn: Staphylococcus sp1, Vibrio vulnificus, V. alginolyticus,  riêng biệt trong nước muối sinh lý (0,85%) và hỗn hợp giữa dịch lọc và các chủng vi khuẩn nói trên đã được thực hiện bằng phương pháp tiêm vào tôm khỏe. Thí nghiệm được tiến hành trong điều kiện: nhiệt độ: 24-28^oC, độ mặn 20‰ và pH: 8,2-8,4. Mô hình thí nghiệm đã được trình bày ở hình 1, kết quả thí nghiệm được ghi nhận tổng hợp và thể hiện ở hình 4.

Hình 4. Tỷ lệ (%) chết tích lũy trung bình của tôm tại các nghiệm thức trong 14 ngày sau cảm nhiễm.

Tôm ở các nghiệm thực (NT) tiêm dịch dưới lọc (0,2 µm) đã bắt đầu chết ở ngày thứ 2 sau cảm nhiễm và chết 100 % vào ngày 4 (ở NT tiêm liều cao 0,1 ml/ tôm) và ngày thứ 5 (ở nghiệm tiêm liều thấp hơn 0,02 ml/tôm). Với NT cho ăn xác tôm bệnh tôm thí nghiệm đã bắt đầu chết muộn hơn so với 2 NT tiêm dịch lọc tôm bắt đầu chết vào ngày thứ 4 và chết 100% vào ngày thứ 8 với các dấu hiệu đặc thù: thân tôm bệnh chuyển màu đỏ bầm đã gặp 100% kết hợp đỏ thân và đốm trắng dưới vỏ đã gặp 45-65%.

Tôm ở các NT tiêm huyễn dịch của mỗi loại vi khuẩn (Staphylococcus sp1, Vibrio vulnificus, V. alginolyticus) cũng đã xảy ra chết ở các ngày thứ 2-4 sau khi tiêm, nhưng với tỷ lệ chết tích lũy thấp, sau 14 ngày cảm nhiệm lần lượt là 25%, 35% và 40% và không xuất hiện bệnh lý đỏ thân hay đỏ thân + đốm trắng ở những con tôm bị chết ở 3 nghiệm thức này.

Tuy nhiên ở các NT tiêm hỗn hợp của dịch dưới lọc 0,2 µm với lần lượt từng loài vi khuẩn nói trên mặc dù lượng dịch lọc tiêm vào cơ thể tôm đã giảm đi 1/2 nhưng tôm thí nghiệm đã chết sớm và nhanh tương đương với NT tiêm dịch lọc liều cao (0,l ml/con tôm), hiện tượng chết bắt đầu vào ngày thứ 2 và cũng chết 100% vào các ngày thứ 5 hoặc thứ 7 sau cảm nhiễm. Các con tôm chết đều bộc lộ dấu hiệu đỏ thân hoặc đỏ thân kết hợp đốm trắng (hình 5). Trong khi đó tôm ở 2 nghiệm thức đối chứng có tỷ lệ chết thấp 5% và 10% sau 14 ngày thí nghiệm và tôm chết không bộc lộ dấu hiệu đỏ thân.

Hình 5. Dấu hiệu đỏ thân hoặc đỏ thân + đốm trắng đã bộc lộ ở tôm bệnh sau cảm nhiễm ở các NT bị cảm nhiễm dịch lọc 0,2 µm

Các mẫu tôm chết có dấu hiệu đỏ thân hoặc đỏ thân kết hợp với đốm trắng đã được thu từ thí nghiệm cảm nhiễm đều có kết quả dương tính với WSSV khi kiểm tra bằng kỹ thuật PCR. Những mẫu tôm chết không bị đỏ thân đã được thu từ 3 nghiệm thức tiêm huyễn dịch vi khuẩn và ở 2 nghiệm thức đối chứng đã cỏ kết quả âm tính với WSSV khi kiểm tra bằng kỹ thuật PCR.

Kết quả thí nghiệm đã chứng tỏ rằng WSSV có trong dịch dưới lọc (0,2 µm) được làm từ tôm bệnh trong PBS chính là tác nhân làm tôm chân trắng bị bệnh và chết với các dấu hiệu đặc trưng của hội chứng chết đỏ. Các loài vi khuẩn: Staphylococcus sp1, Vibrio vulnificus, V. alginolyticus không phải là tác nhân chính gây ra hội chứng này nhưng khi chúng bội nhiễm vào tôm cùng với WSSV đã làm tăng mức độ dữ dội của bệnh, làm tôm chết sớm và nhanh hơn.

4.Kết luận:

Tôm chân trắng (Litopenaeus vannamei) bị hội chứng chết đỏ đã bộc lộ các dấu hiệu sau: tôm yếu giảm ăn, tấp bờ, cơ thể tôm bệnh chuyển sang mầu đỏ bầm, đốm trắng với đường kính 0,5-2,0 mm có thể có hoặc không có mặt dưới cửa vỏ kitin, đặc biệt ở dưới giáp đầu ngực.

Tôm bị bệnh này trong cảm nhiễm nhân tạo có tỷ lệ chết tích luỹ đạt tới 100% sau 4-8 ngày tùy theo cách cảm nhiễm.
Tác nhân chính gây hội chứng chết đỏ ở tôm chân trắng (L. vannamei) nuôi thương phẩm ở các tỉnh Nam Trung bộ là WSSV (white spot syndrome virus).

Các loài vi khuân Staphylococcus sp1, Vibrio vulnificus hoặc V. alginolyticus không phải là tác nhân chính của hội chứng đỏ ở tôm chân trắng nhưng khi các loài vi khuẩn này bội nhiễm cùng với WSSV đã làm tăng tính chất dữ dội của bệnh.