Kỹ thuật chẩn đoán nhanh bệnh tôm

Kỹ thuật LAMP là viết tắt của từ Loop-Mediated Isothermal Amplification có nghĩa là sự khuếch đại ADN ở điều kiện đẳng nhiệt thông qua cấu trúc vòng (móc hay kẹp tóc). LAMP được phát triển đầu tiên vào năm 2000 bởi nhóm tác giả người Nhật. Dù mới được giới thiệu ra mắt hơn 20 năm nhưng LAMP cũng đã được ứng dụng vào nhiều lĩnh vực trong đó có chẩn đoán bệnh trên tôm.

Tôm thẻ chân trắng. Ảnh: cefas.co.uk
Tôm thẻ chân trắng. Ảnh: cefas.co.uk

Kỹ thuật LAMP đã được phát triển và sử dụng trong chẩn đoán nhiều bệnh trên động vật thủy sản (cá, tôm), vì phương pháp này có thể được thực hiện và hoàn thành trong vòng 1 giờ, nó sẽ rút ngắn thời gian phát hiện mầm bệnh cũng như đã được chứng minh có độ nhạy và độ đặc hiệu cao. Đặc biệt thử nghiệm kỹ thuật LAMP đã được áp dụng để phát hiện tác nhân gây bệnh truyền nhiễm trên tôm, bao gồm vi khuẩn, vi bào tử trùng, virus (ADN, ARN),… Với kỹ thuật này có thể phân tích được đa dạng các loại mẫu bệnh phẩm như gan tụy, mang, ruột, máu, cơ, phân tôm, hay mẫu nước và mẫu bùng.

Kỹ thuật LAMPKỹ thuật LAMP trong chẩn đoán tác nhân gây bệnh trên tôm (Kumar et al., 2021)

LAMP trong chẩn đoán bệnh vi bào tử trùng (EHP)

Trong những năm gần đây, sự xuất hiện rộng rãi của EHP đặt ra một thách thức đáng kể đối với ngành công nghiệp nuôi tôm. Chẩn đoán sớm, nhanh chóng và chính xác nhiễm trùng EHP là rất cần thiết để kiểm soát thiệt hại. Thử nghiệm LAMP được thực hiện trên trình tự gen mã hóa protein vách bào tử của EHP. Kỹ thuật LAMP này hiệu quả trong việc phát hiện mầm bệnh EHP ở tất cả mẫu lâm sàng bao gồm gan tụy tôm, mẫu tôm, phân, nước ao và đất. LAMP cho độ nhạy 100% và tính chuyên biệt 100% cùng với sự đánh giá bằng kết quả điện di trên gel. Quá trình xét nghiệm diễn ra nhanh chóng, có thể phát hiện mầm bệnh EHP trong vòng 40 phút và không yêu cầu bất kỳ dụng cụ đắt tiền và trình độ kỹ thuật. 

LAMP trong chẩn đoán bệnh hoại tử gan tụy cấp tính (AHPND)

Bệnh hoại tử gan tụy cấp tính (AHPND) là một bệnh nghiêm trọng trên tôm và gây thiệt hại đáng kể cho ngành nuôi tôm. Tác nhân gây bệnh AHPND đã được xác định là Vibrio parahaemolyticus mang gen độc lực.

Tôm bị hoại tử gan tụyTôm bị hoại tử gan tụy. Ảnh: tanilogic.com

Hai bộ mồi (LAMP-A2 và LAMP-A3) đã được phát triển và xác nhận để sử dụng trong xét nghiệm LAMP nhằm xác định V. parahaemolyticus gây AHPND (VpAHPND). LAMP-A2 và LAMP-A3 đã phát hiện được tất cả 33 chủng VpAHPND. Giới hạn phát hiện của LAMP-A3 là 53 CFU/ml hoặc 0,1 CFU/phản ứng (thấp hơn 10 lần so với LAMP-A2), trong xét nghiệm tôm giống giới hạn phát hiện là 4,4.105 CFU/ml hoặc 8,8.102 CFU/phản ứng. Thử nghiệm thêm đối với 24 mẫu hậu ấu trùng, tôm, trầm tích và nước được thu thập từ một trại nuôi tôm cho thấy VpAHPND được phát hiện hầu hết trong các mẫu trầm tích. Như vậy, các kết quả cho thấy rằng xét nghiệm LAMP dựa trên LAMP-A3, phù hợp để xác định V. parahaemolyticus gây bệnh AHPND trên tôm.

LAMP trong chẩn đoán bệnh đốm trắng (WSSV)

Sử dụng phương pháp LAMP, một hệ thống chẩn đoán có độ nhạy và đặc hiệu cao để phát hiện virus gây bệnh đốm trắng (WSSV) đã được thực hiện.

Tôm bị bệnh đốm trắngTôm bị bệnh đốm trắng. Ảnh: abc.net.au

Một bộ bốn mồi, hai mồi ngoài và hai mồi trong, được thiết kế từ DNA bộ gen WSSV. Thời gian và nhiệt độ phản ứng được tối ưu hóa trong 60 phút ở 65°C, tương ứng. Giới hạn phát hiện trong phương pháp LAMP này lên đến 1 fg, trong khi đó phương pháp Nested PCR với độ nhạy 10 fg. Do đó, quy trình LAMP chuẩn hóa đã được sử dụng để phát hiện sự hiện diện của WSSV trong tim, dạ dày và cơ quan bạch huyết từ tôm bị nhiễm bệnh. Nghiên cứu đã phát triển một quy trình chẩn đoán nhanh chóng và có độ nhạy cao để phát hiện WSSV ở tôm.

LAMP trong chẩn đoán bệnh còi (MBV)

Kỹ thuật LAMP đã được áp dụng để phát hiện bệnh còi do baculovirus Penaeus monodon (MBV), một loại virus gây bệnh phổ biến trong các trại sản xuất tôm giống. Điều kiện thời gian và nhiệt độ tối ưu cho LAMP lần lượt là 60 phút và 63oC. Kỹ thuật này có tính đặc hiệu cao đối với MBV và kết quả âm tính đối với các loài virus khác gây bệnh trên tôm, bao gồm WSSV, IHHNV và HPV. Độ nhạy của LAMP là 10 pg/ml ADN hoặc 10 fg/pứ và nhạy hơn 10 lần so với PCR thông thường trong việc phát hiện MBV đối với mẫu tôm giống.

LAMP trong chẩn đoán bệnh hoại tử cơ quan tạo máu và cơ quan biểu mô (IHHNV)

Kỹ thuật LAMP được áp dụng để chẩn đoán bệnh hoại tử cơ quan tạo máu và cơ quan biểu mô trên tôm thông qua bốn đoạn mồi được thiết kế dựa vào DNA địch của bộ gen IHHNV. DNA đích được khuếch đại và hiển thị trên gel agarose trong vòng 60 phút ở điều kiện đẳng nhiệt ở 64°C.

Ngoài ra, sản phẩm LAMP cũng được xác định bằng cách thêm SYBR Green I để kiểm tra bằng mắt thường. Phản ứng LAMP cũng được đánh giá bằng độ đục màu trắng của magie pyrophosphat. Xét nghiệm có giới hạn phát hiện là 5–500 bản sao của DNA khuôn thông qua đọc kết quả bằng điện di trên gel, SYBR Green I và độ đục trắng khi kiểm tra bằng mắt thường. Độ nhạy phát hiện của LAMP cao hơn 100 lần so với PCR. 

LAMP chẩn đoán bệnh đầu vàng (YHV)

Xét nghiệm khuếch đại đẳng nhiệt qua trung gian phiên mã ngược (RT-LAMP) được phát triển để phát hiện gen glycoprotein cấu trúc của virus đầu vàng (YHV). Xét nghiệm RT-LAMP là một phương pháp khuếch đại gen mới giúp khuếch đại axit nucleic với độ đặc hiệu và độ nhạy cao và nhanh chóng trong điều kiện đẳng nhiệt với một bộ bốn mồi được thiết kế đặc biệt để nhận biết sáu trình tự khác nhau của mục tiêu.

Toàn bộ quy trình rất đơn giản và nhanh chóng, thời gian và nhiệt độ phản ứng được tối ưu hóa trong 60 phút ở 65oC, tương ứng. Phát hiện gen khuếch đại có thể được thực hiện bằng điện di trên gel agarose. Quy trình RT-LAMP chuẩn hóa được sử dụng để phát hiện YHV trong máu và mang từ tôm bị nhiễm bệnh. Đồng thời xác định độ nhạy của kỹ thuật RT-LAMP thì khi tôm nhiễm YHV RT-LAMP được phát hiện ở nồng độ của độ pha loãng 10−6, trong khi Nested RT-PCR phát hiện ở độ pha loãng 10−7, kết quả này cho thấy độ nhạy RT-LAMP chỉ thấp hơn 10 lần so với Nested RT-PCR. Đối với tính đặc hiệu của RT-LAMP thì kết quả hoàn toàn âm tính với WSSV, TSV và RNA của tôm, điều này chứng tỏ phương pháp RT-LAMP có độ đặc hiệu cao đối với YHV. Do đó, kỹ thuật RT-LAMP cực kỳ nhanh chóng, tiết kiệm chi phí, độ nhạy và tính chuyên biệt cao, có tiềm năng hữu ích cho chẩn đoán nhanh để phát hiện YHV trên tôm.

 

Sơ đồSơ đồ của hai mồi bên trong (FIP và BIP) và hai mồi bên ngoài (F3 và B3) cho RT-LAMP (A). Trình tự nucleotide của gen glycoprotein cấu trúc YHV được sử dụng cho các đoạn mồi bên trong và bên ngoài (B) (Nguồn: Mekata et al., 2006)

LAMP chẩn đoán bệnh Taura (STV)

Phương pháp RT-LAMP chẩn đoán virus gây hội chứng Taura là một tác nhân gây bệnh ở tôm thẻ chân trắng. Điều kiện thời gian và nhiệt độ để phát hiện TSV được tối ưu hóa trong 60 phút ở 63°C. Tính chuyên biệt của kỹ thuật này được thực hiện trên các axit nucleic của các mầm bệnh tôm khác (YHV, WSSV) đều cho kết quả âm tính. Việc phát hiện TSV bằng RT-LAMP nhạy hơn 10 lần so với RT-PCR nhưng kém nhạy hơn Nested RT-PCR. Tuy nhiên, phương pháp này thuận tiện hơn, nhanh chóng và không yêu cầu máy PCR phức tạp.

Ưu điểm

Thời gian thực hiện LAMP nhanh hơn so với PCR. Theo đó, thời gian thực hiện PCR trung bình khoảng 2,5-3 giờ, trong khi thời gian thực hiện LAMP trung bình khoảng 1-1,5 giờ. Điều này có ý nghĩa đặc biệt quan trọng trong việc chẩn đoán và xác định bệnh nhanh;

Kết quả của phản ứng LAMP có thể được quan sát ngay dưới ánh sáng thường hoặc soi dưới tia UV.

Hệ thống LAMP không yêu cầu nhiều thiết bị như máy luân nhiệt và chu trình nhiệt. Hơn nữa, hệ thống này không cần đến năng lượng điện (vì có thể sử dụng túi ấm hoặc túi giữ nhiệt). Do đó, có thể giảm được thời gian vận chuyển, phát hiện nhanh, có tính di động và hiệu quả kinh tế cao. Phù hợp với những vùng đang còn thiếu thốn về cơ sở hạ tầng cũng như yếu kém về khoa học công nghệ.

Đăng ngày 08/12/2022
Hồng Huyền @hong-huyen
Kỹ thuật

Sự hình thành khí độc NO2, NH3 trong ao nuôi tôm thẻ chân trắng

Khí độc NH3, NO2 hình thành từ các nguồn khác nhau có trong ao nuôi tôm thẻ chân trắng như chất lơ lửng, phù sa lắng tụ, xác tảo chết, thức ăn dư thừa, phân tôm, vỏ tôm lột, xác tôm chết, bùn đáy ao tồn lưu do sên vét vụ nuôi trước không triệt để.

Nưới ao tôm
• 11:13 29/09/2023

Nuôi tôm 3 giai đoạn là gì? Những lưu ý cần thiết cho từng giai đoạn

Mô hình nuôi tôm 3 giai đoạn đã xuất hiện khá lâu trên thế giới, tuy nhiên mô hình này chỉ thực sự phổ biến tại Việt Nam trong vài năm trở lại đây. Do đó, vẫn còn nhiều người băn khoăn rốt cuộc nuôi tôm 3 giai đoạn là như thế nào?

Mô hình nuôi tôm
• 14:55 27/09/2023

Triển vọng nghề nuôi ốc hương thương phẩm trong ao

Hiện nay, vùng ven biển của các tỉnh trong nước có rất nhiều tiềm năng để phát triển nghề nuôi trồng thủy sản, cùng với các đối tượng thủy sản có giá trị kinh tế cao như tôm, cua, cá,…

Ốc hương
• 13:54 18/09/2023

Một số biện pháp phòng bệnh tổng hợp cho tôm hùm

Nuôi tôm hùm bằng lồng trên biển là hình thức nuôi trong một hệ sinh thái hở nên việc phòng bệnh gặp nhiều khó khăn.

Tôm hùm bông
• 15:21 15/09/2023

Thịt cá koi ăn được không? Nên ăn hay không?

Câu hỏi về việc có nên ăn thịt cá Koi hay không và cá Koi có ăn được không đã thu hút sự chú ý của nhiều người. Chủ đề này đã gây ra nhiều tranh cãi và để trả lời một cách chính xác không phải là điều dễ dàng. Vậy thực hư ra sao?

Cá koi
• 03:24 03/10/2023

Tình hình dịch bệnh mờ đục trên ấu trùng tôm thẻ tại Việt Nam

Theo Cục Thuỷ sản trong quá trình kiểm tra giám sát tình hình sản xuất tôm giống thực tế tại địa phương, tìm hiểu thông tin từ các nghiên cứu mới và tham vấn các nhà khoa học trong nước.

Tôm thẻ
• 03:24 03/10/2023

Sản lượng tôm của Ecuador mang lại tín hiệu vui cho các nhà sản xuất Châu Á

6 tháng đầu năm 2023 thị trường tôm toàn cầu chứng kiến “bi kịch” chưa từng có khi giá trị xuất khẩu liên tiếp sụt giảm. Tuy nhiên, một điểm sáng từ Ecuador đã mang lại tín hiệu vui cho các nhà sản xuất châu Á với dự kiến đạt 1.5 triệu tấn trong năm 2023.

Tôm
• 03:24 03/10/2023

Những ngày quyết gỡ “thẻ vàng” IUU để xây dựng nghề cá phát triển bền vững

Theo kế hoạch của Bộ NN&PTNT, chương trình đón và làm việc với Đoàn thanh tra của Ủy ban Châu Âu (EC) lần 4 về chống khai thác bất hợp pháp, không báo cáo và không theo quy định (IUU) sẽ diễn ra từ ngày 10 - 18/10/2023.

Ngư dân
• 03:24 03/10/2023

Bình Định đẩy mạnh tuyên truyền IUU bằng nhiều hình thức

Sáng ngày 25/9/2023, hơn 20 cán bộ, công chức các ban, ngành đoàn thể xã Cát Khánh, huyện Phù Cát ra quân tuyên truyền lưu động trên các tuyến đường trong xã và cảng cá Đề Gi về phòng, chống khai thác hải sản bất hợp pháp, không khai báo và không theo quy định (IUU).

Ngư dân
• 03:24 03/10/2023