Kỹ thuật chẩn đoán nhanh bệnh tôm

Kỹ thuật LAMP là viết tắt của từ Loop-Mediated Isothermal Amplification có nghĩa là sự khuếch đại ADN ở điều kiện đẳng nhiệt thông qua cấu trúc vòng (móc hay kẹp tóc). LAMP được phát triển đầu tiên vào năm 2000 bởi nhóm tác giả người Nhật. Dù mới được giới thiệu ra mắt hơn 20 năm nhưng LAMP cũng đã được ứng dụng vào nhiều lĩnh vực trong đó có chẩn đoán bệnh trên tôm.

Tôm thẻ chân trắng. Ảnh: cefas.co.uk
Tôm thẻ chân trắng. Ảnh: cefas.co.uk

Kỹ thuật LAMP đã được phát triển và sử dụng trong chẩn đoán nhiều bệnh trên động vật thủy sản (cá, tôm), vì phương pháp này có thể được thực hiện và hoàn thành trong vòng 1 giờ, nó sẽ rút ngắn thời gian phát hiện mầm bệnh cũng như đã được chứng minh có độ nhạy và độ đặc hiệu cao. Đặc biệt thử nghiệm kỹ thuật LAMP đã được áp dụng để phát hiện tác nhân gây bệnh truyền nhiễm trên tôm, bao gồm vi khuẩn, vi bào tử trùng, virus (ADN, ARN),… Với kỹ thuật này có thể phân tích được đa dạng các loại mẫu bệnh phẩm như gan tụy, mang, ruột, máu, cơ, phân tôm, hay mẫu nước và mẫu bùng.

Kỹ thuật LAMPKỹ thuật LAMP trong chẩn đoán tác nhân gây bệnh trên tôm (Kumar et al., 2021)

LAMP trong chẩn đoán bệnh vi bào tử trùng (EHP)

Trong những năm gần đây, sự xuất hiện rộng rãi của EHP đặt ra một thách thức đáng kể đối với ngành công nghiệp nuôi tôm. Chẩn đoán sớm, nhanh chóng và chính xác nhiễm trùng EHP là rất cần thiết để kiểm soát thiệt hại. Thử nghiệm LAMP được thực hiện trên trình tự gen mã hóa protein vách bào tử của EHP. Kỹ thuật LAMP này hiệu quả trong việc phát hiện mầm bệnh EHP ở tất cả mẫu lâm sàng bao gồm gan tụy tôm, mẫu tôm, phân, nước ao và đất. LAMP cho độ nhạy 100% và tính chuyên biệt 100% cùng với sự đánh giá bằng kết quả điện di trên gel. Quá trình xét nghiệm diễn ra nhanh chóng, có thể phát hiện mầm bệnh EHP trong vòng 40 phút và không yêu cầu bất kỳ dụng cụ đắt tiền và trình độ kỹ thuật. 

LAMP trong chẩn đoán bệnh hoại tử gan tụy cấp tính (AHPND)

Bệnh hoại tử gan tụy cấp tính (AHPND) là một bệnh nghiêm trọng trên tôm và gây thiệt hại đáng kể cho ngành nuôi tôm. Tác nhân gây bệnh AHPND đã được xác định là Vibrio parahaemolyticus mang gen độc lực.

Tôm bị hoại tử gan tụyTôm bị hoại tử gan tụy. Ảnh: tanilogic.com

Hai bộ mồi (LAMP-A2 và LAMP-A3) đã được phát triển và xác nhận để sử dụng trong xét nghiệm LAMP nhằm xác định V. parahaemolyticus gây AHPND (VpAHPND). LAMP-A2 và LAMP-A3 đã phát hiện được tất cả 33 chủng VpAHPND. Giới hạn phát hiện của LAMP-A3 là 53 CFU/ml hoặc 0,1 CFU/phản ứng (thấp hơn 10 lần so với LAMP-A2), trong xét nghiệm tôm giống giới hạn phát hiện là 4,4.105 CFU/ml hoặc 8,8.102 CFU/phản ứng. Thử nghiệm thêm đối với 24 mẫu hậu ấu trùng, tôm, trầm tích và nước được thu thập từ một trại nuôi tôm cho thấy VpAHPND được phát hiện hầu hết trong các mẫu trầm tích. Như vậy, các kết quả cho thấy rằng xét nghiệm LAMP dựa trên LAMP-A3, phù hợp để xác định V. parahaemolyticus gây bệnh AHPND trên tôm.

LAMP trong chẩn đoán bệnh đốm trắng (WSSV)

Sử dụng phương pháp LAMP, một hệ thống chẩn đoán có độ nhạy và đặc hiệu cao để phát hiện virus gây bệnh đốm trắng (WSSV) đã được thực hiện.

Tôm bị bệnh đốm trắngTôm bị bệnh đốm trắng. Ảnh: abc.net.au

Một bộ bốn mồi, hai mồi ngoài và hai mồi trong, được thiết kế từ DNA bộ gen WSSV. Thời gian và nhiệt độ phản ứng được tối ưu hóa trong 60 phút ở 65°C, tương ứng. Giới hạn phát hiện trong phương pháp LAMP này lên đến 1 fg, trong khi đó phương pháp Nested PCR với độ nhạy 10 fg. Do đó, quy trình LAMP chuẩn hóa đã được sử dụng để phát hiện sự hiện diện của WSSV trong tim, dạ dày và cơ quan bạch huyết từ tôm bị nhiễm bệnh. Nghiên cứu đã phát triển một quy trình chẩn đoán nhanh chóng và có độ nhạy cao để phát hiện WSSV ở tôm.

LAMP trong chẩn đoán bệnh còi (MBV)

Kỹ thuật LAMP đã được áp dụng để phát hiện bệnh còi do baculovirus Penaeus monodon (MBV), một loại virus gây bệnh phổ biến trong các trại sản xuất tôm giống. Điều kiện thời gian và nhiệt độ tối ưu cho LAMP lần lượt là 60 phút và 63oC. Kỹ thuật này có tính đặc hiệu cao đối với MBV và kết quả âm tính đối với các loài virus khác gây bệnh trên tôm, bao gồm WSSV, IHHNV và HPV. Độ nhạy của LAMP là 10 pg/ml ADN hoặc 10 fg/pứ và nhạy hơn 10 lần so với PCR thông thường trong việc phát hiện MBV đối với mẫu tôm giống.

LAMP trong chẩn đoán bệnh hoại tử cơ quan tạo máu và cơ quan biểu mô (IHHNV)

Kỹ thuật LAMP được áp dụng để chẩn đoán bệnh hoại tử cơ quan tạo máu và cơ quan biểu mô trên tôm thông qua bốn đoạn mồi được thiết kế dựa vào DNA địch của bộ gen IHHNV. DNA đích được khuếch đại và hiển thị trên gel agarose trong vòng 60 phút ở điều kiện đẳng nhiệt ở 64°C.

Ngoài ra, sản phẩm LAMP cũng được xác định bằng cách thêm SYBR Green I để kiểm tra bằng mắt thường. Phản ứng LAMP cũng được đánh giá bằng độ đục màu trắng của magie pyrophosphat. Xét nghiệm có giới hạn phát hiện là 5–500 bản sao của DNA khuôn thông qua đọc kết quả bằng điện di trên gel, SYBR Green I và độ đục trắng khi kiểm tra bằng mắt thường. Độ nhạy phát hiện của LAMP cao hơn 100 lần so với PCR. 

LAMP chẩn đoán bệnh đầu vàng (YHV)

Xét nghiệm khuếch đại đẳng nhiệt qua trung gian phiên mã ngược (RT-LAMP) được phát triển để phát hiện gen glycoprotein cấu trúc của virus đầu vàng (YHV). Xét nghiệm RT-LAMP là một phương pháp khuếch đại gen mới giúp khuếch đại axit nucleic với độ đặc hiệu và độ nhạy cao và nhanh chóng trong điều kiện đẳng nhiệt với một bộ bốn mồi được thiết kế đặc biệt để nhận biết sáu trình tự khác nhau của mục tiêu.

Toàn bộ quy trình rất đơn giản và nhanh chóng, thời gian và nhiệt độ phản ứng được tối ưu hóa trong 60 phút ở 65oC, tương ứng. Phát hiện gen khuếch đại có thể được thực hiện bằng điện di trên gel agarose. Quy trình RT-LAMP chuẩn hóa được sử dụng để phát hiện YHV trong máu và mang từ tôm bị nhiễm bệnh. Đồng thời xác định độ nhạy của kỹ thuật RT-LAMP thì khi tôm nhiễm YHV RT-LAMP được phát hiện ở nồng độ của độ pha loãng 10−6, trong khi Nested RT-PCR phát hiện ở độ pha loãng 10−7, kết quả này cho thấy độ nhạy RT-LAMP chỉ thấp hơn 10 lần so với Nested RT-PCR. Đối với tính đặc hiệu của RT-LAMP thì kết quả hoàn toàn âm tính với WSSV, TSV và RNA của tôm, điều này chứng tỏ phương pháp RT-LAMP có độ đặc hiệu cao đối với YHV. Do đó, kỹ thuật RT-LAMP cực kỳ nhanh chóng, tiết kiệm chi phí, độ nhạy và tính chuyên biệt cao, có tiềm năng hữu ích cho chẩn đoán nhanh để phát hiện YHV trên tôm.

 

Sơ đồSơ đồ của hai mồi bên trong (FIP và BIP) và hai mồi bên ngoài (F3 và B3) cho RT-LAMP (A). Trình tự nucleotide của gen glycoprotein cấu trúc YHV được sử dụng cho các đoạn mồi bên trong và bên ngoài (B) (Nguồn: Mekata et al., 2006)

LAMP chẩn đoán bệnh Taura (STV)

Phương pháp RT-LAMP chẩn đoán virus gây hội chứng Taura là một tác nhân gây bệnh ở tôm thẻ chân trắng. Điều kiện thời gian và nhiệt độ để phát hiện TSV được tối ưu hóa trong 60 phút ở 63°C. Tính chuyên biệt của kỹ thuật này được thực hiện trên các axit nucleic của các mầm bệnh tôm khác (YHV, WSSV) đều cho kết quả âm tính. Việc phát hiện TSV bằng RT-LAMP nhạy hơn 10 lần so với RT-PCR nhưng kém nhạy hơn Nested RT-PCR. Tuy nhiên, phương pháp này thuận tiện hơn, nhanh chóng và không yêu cầu máy PCR phức tạp.

Ưu điểm

Thời gian thực hiện LAMP nhanh hơn so với PCR. Theo đó, thời gian thực hiện PCR trung bình khoảng 2,5-3 giờ, trong khi thời gian thực hiện LAMP trung bình khoảng 1-1,5 giờ. Điều này có ý nghĩa đặc biệt quan trọng trong việc chẩn đoán và xác định bệnh nhanh;

Kết quả của phản ứng LAMP có thể được quan sát ngay dưới ánh sáng thường hoặc soi dưới tia UV.

Hệ thống LAMP không yêu cầu nhiều thiết bị như máy luân nhiệt và chu trình nhiệt. Hơn nữa, hệ thống này không cần đến năng lượng điện (vì có thể sử dụng túi ấm hoặc túi giữ nhiệt). Do đó, có thể giảm được thời gian vận chuyển, phát hiện nhanh, có tính di động và hiệu quả kinh tế cao. Phù hợp với những vùng đang còn thiếu thốn về cơ sở hạ tầng cũng như yếu kém về khoa học công nghệ.

Đăng ngày 08/12/2022
Hồng Huyền @hong-huyen
Kỹ thuật
Bình luận
avatar
avatar avatar
(>item.username<)

(>item.add_time*1000 | date:'y-M-d HH:mm:ss'<)

(>item.total_like<)

(>item.content<)

An toàn trong sử dụng thiết bị nuôi tôm

Để không ngừng phát triển, theo kịp sự tiến bộ của thế giới thì việc ứng dụng các thiết bị công nghệ trong nuôi tôm hầu như không thể thiếu nhằm đẩy mạnh năng suất, gia tăng giá trị kinh tế.

Ao nuôi tôm
• 10:16 25/04/2023

Hướng dẫn một số giải pháp kỹ thuật nuôi cá chim vây vàng trong lồng

Cá chim vây vàng (Trachinotus blochii) sống ở biển, có tốc độ tăng trưởng nhanh, khả năng chống chịu với môi trường tốt, có thể nuôi với nhiều hình thức như: lồng bè, ao đầm.

Cá chim vây vàng
• 11:31 19/04/2023

Quy trình nuôi tôm hiệu quả cho người mới bắt đầu (Phần 2)

Kỹ thuật nuôi tôm là cụm từ nhiều người tìm kiếm vì đây là các bước quan trọng quyết định đến năng suất của tôm thẻ.

Tôm thẻ
• 10:33 31/03/2023

Quy trình nuôi tôm hiệu quả cho người mới bắt đầu (Phần 1)

Những năm gần đây, nghề nuôi tôm của Việt Nam đang có những bước tiến rõ rệt trên bản đồ xuất khẩu ra toàn thế giới. Chính vì thế, hiểu rõ những cách cơ bản để nuôi tôm sao cho phù hợp, đạt năng suất, hiệu quả kinh tế cao luôn là bài toán quan trọng đối với nhiều hộ nuôi tôm hiện nay.

Ao nuôi
• 10:25 30/03/2023

Sức đề kháng tôm nuôi suy giảm theo giá bán

Do giá bán giảm, chủ ao tiết kiệm chi phí đầu vào và điều kiện chăm sóc khiến tôm nuôi giảm sức đề kháng, từ đó dễ mắc bệnh thường gặp.

Ao nuôi
• 20:33 30/05/2023

Ăn trứng cá sấu hỏa tiễn nặng 10kg, 6 người nhập viện

Sau ba giờ ăn trứng cá sấu hỏa tiễn, 6 người đàn ông ở Hòa Bình có biểu hiện đau bụng, nôn, tiêu chảy, phải nhập viện cấp cứu.

Cá sấu hỏa tiễn
• 20:33 30/05/2023

Khởi nghiệp nuôi cá đặc sản tại huyện biên giới cho thu nhập cao

Mô hình khởi nghiệp nuôi cá lăng, cá chạch ao của anh Nguyễn Hoàng Anh Quốc ở xã Lộc Hiệp, huyện biên giới Lộc Ninh, tỉnh Bình Phước đang mang lại hiệu quả kinh tế cao.

Cá heo
• 20:33 30/05/2023

Nhơn Hải bắt sao biển gai và dọn rác dưới đáy biển

Sáng ngày 24.5, Tổ bảo vệ san hô xã Nhơn Hải đã tổ chức bắt sao biển gai và dọn rác dưới biển tại khu vực biển Hòn Khô nhỏ (xã Nhơn Hải).

Bắt sao biển gai
• 20:33 30/05/2023

8 loại bệnh thường gặp ở tôm thẻ chân trắng (Phần cuối)

Tôm thẻ chân trắng là loại thủy sản được nuôi nhiều ở các tỉnh nước ta mang lại lợi nhuận kinh tế cao. Tuy nhiên, trước tình hình dịch bệnh xuất hiện, khiến con tôm thẻ bị chết nhiều ảnh hưởng đến năng suất nuôi trồng của bà con.

Tôm thẻ
• 20:33 30/05/2023