Việt Nam bước đầu sản xuất tolerine hạn chế virus đốm trắng trên tôm

Ở Việt Nam, virus gây hội chứng đốm trắng (White spot syndrome virus - WSSV) được phát hiện năm 1993 và từ đó đến nay chúng luôn là một trong những nguyên nhân chủ yếu gây thiệt hại kinh tế lớn cho nghề nuôi tôm. Theo Cục Thú Y (Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn) năm 2012, bệnh đốm trắng đã xuất hiện ở vùng nuôi tôm của 19 tỉnh thành trên cả nước với tổng diện tích bệnh là 8.108,5 hecta. Bảy tháng đầu năm 2013, dịch bệnh đốm trắng đã xuất hiện và lây lan nhanh tại 23 tỉnh với tổng diện tích bệnh là 7.030 ha (Cục Thú Y, 2012, 2013). Nhằm giảm thiểu thiệt hại do dịch bệnh đốm trắng gây ra, các biện pháp phòng bệnh bằng thảo dược, bằng chất kích thích miễn dịch và đặc biệt bằng protein/ADN tái tổ hợp (vaccine/tolerine),... đã thu hút sự quan tâm của nhiều nhà nghiên cứu nhất là sau khi hiện tượng “đáp ứng miễn dịch” (quasi-immune response) trên tôm (Venegas et al., 2000) được công bố.

Sản xuất tolerine hạn chế virus gây bệnh đốm trắng trên tôm

Việc sử dụng kỹ thuật sản xuất protein ADN tái tổ hợp đã được nghiên cứu ở Việt Nam với mục tiêu phát triển kháng thể đa dòng trong chẩn đoán bệnh đốm trắng đã được tiến hành tuy nhiên hiện chưa có nghiên cứu nào ứng dụng kỹ thuật này trong việc nghiên cứu chế tạo tolerine phòng bệnh đốm trắng trên tôm.

Trước thực tế này, với mong muốn có thể tạo ra được tolerine có khả năng hạn chế sự lây lan của virus gây bệnh đốm trắng (bằng con đường thức ăn) trên tôm Sú nuôi thương phẩm góp phần giảm thiểu tôm chết do bệnh đốm trắng gây ra. Cụ thể là tạo được 1 dòng tế bào mang gene virus đốm trắng có đặc tính sinh protein ổn định sau cấy chuyển và xây dựng được quy trình (quy mô phòng thí nghiệm) sản xuất và sử dụng tolerine có khả năng hạn chế sự lây lan của virus gây bệnh đốm trắng (bằng con đường thức ăn), nhóm nghiên cứu do bà Ngô Thị Ngọc Thủy, Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản II đứng đầu đã đề xuất và được giao thực hiện nghiên cứu đề tài: “Bước đầu nghiên cứu, sản xuất tolerine có khả năng hạn chế lây lan của virus gây bệnh đốm trắng trên tôm Sú nuôi thương phẩm ở đồng bằng Sông Cửu Long”.

Sau 30 tháng thực hiện (từ tháng 1/2013 - tháng 6/2015), nhóm nghiên cứu đã thu được các kết quả như sau: 

- Về nghiên cứu, sản xuất tolerine

+ Đoạn gene VP28 của virus gây bệnh đốm trắng trên tôm đã được tối ưu, gắn với plasmid pPIC9K và dòng hóa thành công vào tế bào nấm men khả biến P. pastoris GS115.

Pichia pastoris Hình: xpress-biologics

+ Chọn được 1 chủng nấm men Pichia patoris (chủng 11) có chứa pPIC9K-VP28 trong bộ gene có kiểu hình Mut+, có khả năng biểu hiện được protein mục tiêu VP28 trong điều kiện cảm ứng bằng methanol với nồng độ 2%. Chủng này có khả năng sinh protein tái tổ hợp rVP28 ổn định trong 15 lần cấy chuyển. 

+ Tolerine đã được sản xuất từ chủng nấm men có mang vector tái tổ hợp pPIC9KVP28 có sự hiện diện của protein rVP28 trong cả tế bào nấm men và dịch; lượng tế bào nấm men có trong tolerine là 3,1 x 10¹⁰ tế bào.ml-1.

+ Tolerine an toàn cho tôm nuôi, tỷ lệ an toàn là 100% - Tôm được cho ăn thức ăn có bao tolerine ở các nồng độ khác nhau: 3,1 x 10⁹; x 10⁸; x 10⁷ tế bào.ml-1 và dịch tương ứng có tỷ lệ sống tương đương với tôm ăn thức ăn thương mại.

- Đánh giá hiệu quả tolerine trên tôm sú

+ Thí nghiệm gây nhiễm ở ngày thứ 16 sau khi tôm được dùng tolerine đã xác định tôm dùng liều 3,1x 10⁹ tb nấm men và dịch tương ứng có tỷ lệ bảo hộ cao nhất 49,5%. Tỷ lệ này cao khác biệt các lô tôm được dùng liều 3,1x10⁸tb (30,2%) và 3,1x10⁷tb (25,9%) (P<0,05).

+ Thời gian 10 ngày dùng tolerine liều 3,1x10⁹tb nấm men và dịch tương ứng được xem là liều thích hợp cho tôm có tỷ lệ bảo hộ tốt nhất. Tỷ lệ bảo hộ của tôm khi được dùng liều tolerine này là 52,3% không khác biệt với tỷ lệ bảo hộ khi tôm được dùng cùng liều trong 15 ngày (52,3%) (P>0,05) và khác biệt có ý nghĩa khi được dùng trong 7 ngày (42,6%) (P<0,05).

+ Tolerine khi được dùng 10 ngày liều 3,1x10⁹tb nấm men và dịch tương ứng cho tỷ lệ bảo hộ cao nhất (58,7%) trên tôm trước WSSV trong giai đoạn 10 ngày. Tỷ lệ này thấp khác biệt ở giai đoạn 15 ngày (42,7%) hoặc 30 ngày (4,0%) (P<0,05).

+ Tỷ lệ bảo hộ của tolerine tăng khi chúng được cung cấp 2 lần cho tôm; tuy nhiên, tỷ lệ này chưa biểu thị hiệu quả bảo hộ tăng rõ rệt so với việc dùng tolerine 1 lần do không khác biệt có ý nghĩa thống kê (P>0,05). Tỷ lệ bảo hộ cao nhất của tôm khi được dùng 2 lần tolerine là 62,7% đạt được ở giai đoạn 10 ngày sau khi dùng tolerine lần 2.

+ Tolerine này chưa thể hiện khả năng hạn chế lây nhiễm WSSV trong quần đàn do hệ số sinh cơ bản R của cả hai nhóm đối chứng (2,96 – 3,33) và thí nghiệm (2,08 – 3,29) đều lớn hơn 1; không có sự khác biệt có ý nghĩa về hệ số R giữa các lô có và không dùng tolerine.

- Nghiên cứu quy trình sản xuất, sử dụng và bảo quản tolerine

+ Một quy trình sản xuất tolerine quy mô phòng thí nghiệm đã được xây dựng. Quy trình bao gồm các công đoạn từ việc dòng hóa gene VP28 đã tối ưu vào vector pPIC9K và điện biến nạp vào tế bào P.pastoris đến quá trình sàng lọc, chọn 1 chủng nấm men có khả năng biểu hiện protein tái tổ hợp tốt nhất, có tốc độ sinh trưởng cao nhất để sản xuất tolerine phòng bệnh đốm trắng cho tôm Sú. Quy trình đã được ứng dụng trong 10 đợt sản xuất, sản xuất được 2 lít tolerine có mật độ tế bào ổn định là 3,1 ± 2,4 x 10¹⁰ tế bào nấm men.ml-1

+ Một quy trình sử dụng và bảo quản tolerine quy mô phòng thí nghiệm đã được soạn thảo. Quy trình bao gồm các công đoạn chuẩn bị tolerine, trộn tolerine vào thức ăn, cách cho ăn và bảo quản tolerine để đạt được hiệu quả bảo hộ cao nhất. Quy trình được ứng dụng trong quá trình thực hiện 7 thí nghiệm và ở giai đoạn cho ăn tolerine, tôm đều có tỷ lệ sống cao tương đương tôm dùng thức ăn thương mại và tolerine đều thể hiện rõ hiệu

Nghiên cứu này mới sản xuất tolerine ở quy mô nhỏ trong các bình tam giác; do đó nhóm nghiên cứu đề nghị cần thiết có những nghiên cứu tiếp theo trên quy mô nồi lên men sinh học để chủng nấm men được phát triển trong điều kiện tối ưu, nâng cao hiệu quả của quá trình sinh tổng hợp protein tái tổ hợp VP28. Ngoài ra, nghiên cứu này chưa đi sâu vào đánh giá các thông số miễn dịch của tôm trong thời gian cho ăn tolerine và gây nhiễm, do đó cần có những nghiên cứu bổ sung về vấn đề này để kết quả nghiên cứu được hoàn thiện hơn. Để tăng cường tỷ lệ bảo hộ của tolerine, cần có những nghiên cứu sâu hơn về phương thức dùng tolerine như việc cho tôm ăn tolerine là tế bào nấm men có chứa rVP28 đã được phá vỡ màng tế bào. 

Trong nghiên cứu này, mặc dù tolerine có thể bảo vệ được tôm trước WSSV, song chúng không hạn chế được khả năng lây lan của virus trong quần đàn. Do đó, cần có những nghiên cứu tiếp theo về các giải pháp kỹ thuật, quản lý kết hợp với việc sử dụng tolerine để làm giảm khả năng lây lan của virus, hạn chế sự bùng phát của dịch bệnh đốm trắng. Các thí nghiệm bảo quản tolerine hầu như mới chỉ dừng lại ở việc đánh giá sự hiện diện của protein tái tổ hợp VP28 theo thời gian mà chưa đánh giá được sự biến đổi về hoạt tính hay khả năng bảo vệ của chúng nên cần có những nghiên cứu tiếp theo về vấn đề này. Cuối cùng, cần có thêm các nghiên cứu sâu về phương thức bảo quản tolerine như bảo quản bằng đông khô, hoặc bổ sung chất bảo quản để có thể đưa sản phẩm ứng dụng ngoài thực.