Chẩn đoán nhanh, hiệu quả bệnh đốm trắng bằng phương pháp nested PCR

Tôm là đối tượng mang lại lợi ích cao về kinh tế nên tình hình nuôi trồng tôm trên thế giới nói chung và ở Việt Nam nói riêng đang có xu hướng phát triển nhanh. Đi đôi với sự mở rộng quy mô và hình thức nuôi tôm là sự bùng phát của dịch bệnh và virus gây bệnh liên quan gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến sự phát triển bền vững của nghề nuôi tôm. Các bệnh virus quan trọng trên tôm thẻ là virus gây bệnh đốm trắng (white spot syndrome virus – WSSV), virus gây hội chứng Taura (Taura Syndrome Virus – TSV), virus gây bệnh IHHNV (Infectious Hypothermal and Hematopoietic Necrosis Virus, IHHNV), bệnh hoại tử tuyến ruột giữa (Baculovirus Migut and Necrosis – BMN),… Trong đó, bệnh đốm trắng do WSSV gây ra là một trong các bệnh nguy hiểm thường gặp phổ biến trên tôm gây tỷ lệ chết khi bị nhiễm có thể lên đến 80 - 100% sau 7 - 10 ngày nhiễm.

Ở Việt Nam, bệnh đốm trắng cũng đã bùng phát mạnh, lây lan nhanh nhất là ở các vùng nuôi tôm trọng điểm và chưa có phương pháp đặc trị hữu hiệu. Do tỷ lệ chết của tôm đạt tỷ lệ chết rất cao sau thời gian ngắn khi bắt đầu nhiễm, nên việc kiểm tra và phát hiện sớm bệnh để kịp thời có các biện pháp nhằm giảm thiệt hại cho người nuôi tôm. Vấn đề đặt ra là phải có cách để phát hiện tác nhân bệnh trong thời gian ngắn nhất. Hiện nay các kỹ thuật trong phòng thí nghiệm như kỹ thuật mô học, phản ứng chuỗi trùng hợp (PCR) là một trong những biện pháp hữu hiệu, đáng tin cậy giúp phát hiện mầm bệnh trong giai đoạn sớm nhất.

Phương pháp phản ứng chuỗi trùng hợp (Polymerase Chain Reaction – PCR)

PCR là phương pháp sinh học phân tử sử dụng các phản ứng nối tiếp nhau để khuếch đại số lượng bản sao của một trình tự DNA. Mẫu bệnh cũng như vậy được khuếch đại lên về số lượng từ đó dễ dàng phát hiện được mẫu bệnh. 

Quy trình thực hiện PCR:

• Biến tính DNA: Nâng nhiệt độ để tách rời 2 mạch của phân tử DNA (thường mất từ 15-30 giây).
• Bắt cặp: Hạ nhiệt độ để tạo điều kiện cho các mồi bắt cặp vào mạch DNA (thường mất khoảng 10-30 giây).
• Kéo dài: Nâng nhiệt độ đến độ cao thích hợp để enzyme tổng hợp nên DNA (thường mất khoảng 1 phút).

Sau một chu kì thì số DNA được nhân lên 2 lần, lặp đi lặp lại nhiều lần, thường là 30-40 chu kì, số lược bản sao lúc này được nhân lên khoảng 106 lần.

Phản ứng chuỗi trùng hợp PCR giúp cho phát hiện được mầm bệnh được gây ra trong thời gian ngắn, cho phép việc xác định tác nhân vi sinh không thể nuôi cấy trong phòng thí nghiệm lâm sàng vì khả năng dịch cao hay khó nuôi cấy. Từ đó, giúp cho người nuôi có thể đưa ra những can thiệp kịp thời nhầm hạn chế thấp nhất thiệt hại mà bệnh có thể đem lại, đặc biệt là bệnh WSSV.

Mặc dù, mang lại nhiều lợi ích trong việc phát hiện bệnh sớm những PCR vẫn có nhiều hạn chế như: yêu cầu người làm có kĩ thuật chuyên môn, dễ bị tạp nhiễm gây dương tính giả, độ nhạy còn thấp, chưa xác định mật độ cảm nhiễm của mầm bệnh,... Vì vậy, các nhà nghiên cứu không ngừng nâng cấp kĩ thuật này và cho cả những quy trình hoàn thiện hơn trong đó có nested- PCR

Nested PCR xác định chính xác bệnh WSSV trong thời gian ngắn

Kỹ thuật này cũng dựa trên nguyên lý chung của kỹ thuật PCR nhưng có nhưng hoàn thiện hơn về hoạt tính của enzyme được sử dụng và thiết kế 2 cặp đoạn mồi đặc hiệu hơn. Đặc biệt hơn PCR là nested PCR bao gồm liên tiếp 2 phản ứng PCR, kĩ thuật viên sử dụng 2 cặp đoạn mồi đặc hiệu cho 2 phản ứng liên tiếp này. Đầu tiên, cặp đoạn mồi được thiết kế để khuếch đại 1 vùng DNA, trong đó có chứa DNA mong muốn. Sau đó, sản phẩm của quá trình trên được dùng cho phản ứng PCR với cặp đoạn mồi thứ 2 đặc hiệu cho đoạn DNA mong muốn.

Các nhà nghiên cứu ở Đại học Cần Thơ và ở đã có báo cáo thực hiện quy trình nested PCR để phát hiện bệnh đốm trắng WSSV trên tôm và cho ra những đánh giá về qui trình nested-PCR được phát triển phù hợp với điều kiện thực tế với các thay đổi về thành phần hóa chất tham gia phản ứng và chu kỳ nhiệt của phản ứng. Kết quả ghi nhận khả năng sử dụng tốt của qui trình PCR trong việc phát hiện WSSV từ nhiều đối tượng cảm nhiễm, với độ nhạy tương đối cao và thời gian khuếch đại ngắn (2 giờ). Ở Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh, cũng đã thực hiện nghiên cứu và đánh giá khả năng phát hiện tôm nhiễm WSSV, mẫu lấy từ Cà Mau, bằng nested PCR và mang lại đánh giá tốt cho kĩ thuật này về độ chính xác và độ nhạy cũng như trong thời gian ngắn.