Điều tra bệnh mờ đục trên ấu trùng post của tôm thẻ (TPD) ở Trung Quốc

Trong vòng ba ngày kể từ khi xuất hiện triệu chứng, tỷ lệ mắc bệnh và gây chết ở tôm nuôi có thể lên tới 90%. Bệnh có khả năng lây nhiễm cao, khiến tôm ngừng ăn và suy giảm sức khỏe. Gan tụy tôm nhợt nhạt, ruột giữa và dạ dày trống rỗng. Màu sắc cơ thể thay đổi từ phần đầu ngực đến phần bụng, trở nên trong suốt hoặc bán trong suốt. Sau đó, bệnh lây lan nhanh chóng sang các vùng nuôi khác, cho thấy xu hướng lây lan dịch bệnh nhanh chóng (Harkell, 2020a; Harkell, 2020b). Một chủng Vibrio parahaemolyticus mới và có độc lực cao, được gọi là V. parahaemolyticus gây ra TPD (VpTPD), được phát hiện là nguyên nhân gây ra căn bệnh này (Zou và cộng sự, 2020). 

Bằng cách phân tích khả năng gây bệnh của các protein trọng lượng phân tử khác nhau của VpTPD trên ấu trùng post tôm thẻ, kết hợp với phân tích khối phổ, phân tích so sánh bộ gen, điều tra dịch tễ học và thử nghiệm cảm nhiễm VpTPD, Liu Shuang et al. đã xác định protein độc lực mới, protein độc lực cao Vibrio (VHVP), là yếu tố độc lực chính của VpTPD. VHVP-2, được mã hóa bởi các gen độc lực vhvp-2 nằm trên plasmid 187, 791bp, được xác định là yếu tố độc lực chính của VpTPD và là yếu tố không thể thiếu đối với độc lực gây chết của V. parahaemolyticus đối với ấu trùng post tôm (Liu et al. , 2023).

Trên thực tế, phân tích sâu hơn về plasmid này dựa trên bộ gen so sánh và phép đo phổ khối, các tác giả đã tìm thấy ngoại trừ gen độc lực chính của vhvp-2 mã hóa protein VHVP-2 (chứa các miền độc tố được bảo tồn SpvB và TcdB), còn có hai gen độc lực tiềm năng khác. vhvp-1 mã hóa protein VHVP-1 (trọng lượng phân tử (MWs)>100kDa) và vhvp-3 mã hóa protein độc lực tiềm tàng (MWs khoảng 100kDa) trong plasmid độc lực 187, 791bp.

Mặc dù vhvp-1 và vhvp-3 không được chứng minh là gen độc lực chính của VpTPD trong nghiên cứu trước đây, nhưng chức năng của chúng đối với độc lực gây chết đối với tôm ấu trùng post vẫn đáng để khám phá thêm. Theo kết quả dự đoán của gen mã hóa 187, 791bp plasmid bằng cách sử dụng Dịch vụ CD Search trực tuyến trong NCBI, yếu tố độc lực VHVP-1 sở hữu các vùng bảo tồn của phức hợp độc tố Tc, miền liên quan đến TcA, neuraminidase -like và protein độc lực Salmonella 28,1kDa A, trong khi yếu tố độc lực VHVP-3 sở hữu miền liên quan đến TccC được bảo tồn. Coi các miền TcA và TccC là thành phần quan trọng của độc tố (Lyerly và cộng sự, 1982; Zhan và cộng sự, 2016), chức năng gây độc gây chết đối với tôm ấu trùng post của các gen liên quan của chúng trong plasmid VpTPD 187, 791bp thú vị và có giá trị nghiên cứu sâu. Nghiên cứu mới đây của nhóm tác giả này đã tiến hành nhằm phân lập, xác định và phân tích khả năng gây bệnh của các mầm bệnh vi khuẩn có khả năng gây nhiễm TPD trên tôm được thu thập từ các tỉnh khác nhau ở Trung Quốc để hiểu các đặc điểm sinh học cơ bản của mầm bệnh này. 

Kết quả phân lập và phát hiện mầm bệnh  

Tổng cộng có 448 chủng vi khuẩn có khả năng gây bệnh đã được phân lập và định danh từ các mẫu tôm được thu thập từ địa phương. Loại vi khuẩn phổ biến nhất là Vibrio spp. chiếm 53,79% (241/448) trong tổng số. Sau đó, 9 chủng mang gen độc lực của VpTPD đã được chọn lọc từ 448 vi khuẩn nói trên bằng phương pháp PCR và phân tích trình tự gen 16S rRNA cho thấy cả 9 chủng này đều thuộc Vibrio. Trong số 9 chủng vi khuẩn có khả năng gây bệnh này, 2 chủng mang 3 gen nghi ngờ có độc lực (vhvp-1, vhvp-2 và vhvp-3), 4 chủng mang 2 gen nghi ngờ có độc lực và 3 chủng mang một gen nghi ngờ có độc lực (Bảng 1).

Phân tích khả năng gây bệnh của các chủng VTPD nghi ngờ

Sau khi được cảm nhiễm ngâm với các chủng vi khuẩn ở nồng độ 104 CFU/mL, nhóm tôm đối chứng dương (Vp-JS20200428004–2) đã chết trong vòng 64 giờ, cho thấy các triệu chứng lâm sàng điển hình của TPD. Ngược lại, nhóm đối chứng âm không có triệu chứng rõ ràng  và tôm vẫn khỏe. Trong số các chủng vi khuẩn được thử nghiệm, các nhóm thử nghiệm gồm 20.220.614.001–2, 20.220.614.004–1 và 20.220.614.009–1 cho thấy tỷ lệ chết tích lũy rõ ràng tương tự như nhóm đối chứng dương (Vp-JS20200428004–2) (Hình 2b).

Ngoài ra, ba nhóm tôm thí nghiệm này cho thấy các dấu hiệu lâm sàng điển hình của TPD ở giai đoạn nhiễm trùng sớm, giữa và muộn (Hình 2c). Kết quả mô bệnh học của các phần mô phù hợp với kết quả của các nhóm tôm bị bệnh tự nhiên. Các nhóm khác cho thấy tỷ lệ tôm chết không đáng kể hoặc chỉ có một số ít tôm chết mà không có triệu chứng TPD điển hình. 

Sau đó, Số liệu thống kê SPSS 27 của IBM được sử dụng để tính toán thời gian gây chết trung bình (LT50) và khoảng tin cậy 95%. Kết quả Vp-JS20200428004-2 và 3 chủng (20220614001-2, 20220614004-1, và 20220614009-1) ở nồng độ 104 CFU/mL trên ấu trùng post tôm thẻ như sau: 32,3 h (29,0) —35,5), 37,0 giờ (33,4—40,5), 34,8 giờ (31,1—38,5) và 20220614009–1: 43,5 giờ (39,6—47,4). Kiểm tra mô bệnh học cho thấy ấu trùng post ở nhóm thử nghiệm (20220614001-2, 20220614004-1, 20220614009-1), tương tự như nhóm đối chứng dương tính (Vp-JS20200428004-2), cho thấy sự hoại tử một phần và bong tróc của các tế bào biểu mô ở cả ống gan tụy và ruột giữa.

Trong giai đoạn đầu của nhiễm trùng, các tế bào biểu mô của ống gan tụy và ruột giữa bị bong ra một chút và vi khuẩn tích tụ trong lòng. Ở giai đoạn giữa, hoại tử nặng hơn và bong tróc một phần (mũi tên đen) của các tế bào biểu mô trong ống gan tụy và ruột giữa (Hình 2d). Ở giai đoạn muộn, có sự hoại tử và bong tróc nghiêm trọng các ống gan tụy và mô ruột giữa, với một số lượng lớn vi khuẩn xâm chiếm lòng ống (mũi tên đỏ). Ngược lại, tôm giống khỏe mạnh không có thay đổi mô bệnh học đáng kể ở ống gan tụy và ruột giữa (Hình 2d). 

Hình 2. Phân tích khả năng gây bệnh của các chủng mang gen độc lực VpTPD được xác định bằng thử thách

Phân tích khả năng gây bệnh của các chủng mang gen độc lực VpTPD được xác định bằng thử nghiệm cảm nhiễm. (a) Sơ đồ phân lập, phát hiện và phân tích khả năng gây bệnh của các vi khuẩn gây bệnh có khả năng gây nhiễm TPD ở tôm. (b) Tỷ lệ tử vong tích lũy của tôm bị nhiễm các chủng khác nhau. (c) Dấu hiệu lâm sàng của tôm thẻ chân trắng bị nhiễm VpTPD. Người bệnh (người bên trái) có biểu hiện hội chứng đường tiêu hóa trống rỗng và gan tụy nhợt nhạt hoặc không màu. Cá thể phù hợp là ấu trùng post khỏe mạnh. Thanh tỷ lệ = 2 mm. (d) Hình ảnh mô bệnh học của gan tụy và ruột của tôm thẻ tôm thẻ từ nhóm cảm nhiễm VTPD ở các giai đoạn khác nhau sau nhiễm bệnh (bao gồm giai đoạn đầu, giai đoạn giữa, giai đoạn muộn). Mũi tên đen biểu thị các tế bào biểu mô gan tụy hoặc ruột bị bong ra; mũi tên màu đỏ biểu thị khối vi khuẩn VTPD tập trung. 

Kết quả về nhận dạng vi khuẩn 

Kết quả phân tích trình tự gen 16S rRNA cho thấy các chủng 20220614001-2, 20220614004-1 và 20220614009-1 đều thuộc chi Vibrio. Sau đó, phân tích ghép nối nhiều gen của ba gen mã hóa protein (rctB, rpoD và toxR) sau đó đã được thực hiện để phân tích trình tự gen liên kết của ba chủng này và xây dựng cây phát sinh gen tương ứng (Hình 3). Kết quả chỉ ra rằng chủng 20220614001-2 thuộc về V. natriegens, chủng 20220614004-1 phân cụm với V. parahaemolyticus và chủng 20220614009-1 phân cụm với V. campbellii. Dựa trên kết quả định danh vi khuẩn và thí nghiệm lây nhiễm nhân tạo, các tác giả quan sát thấy các chủng Vibrio khác nhau mang gen độc lực chính của VpTPD có thể lây nhiễm sang ấu trùng post của tôm thẻ và gây ra bệnh TPD. Điều này cho thấy sự đa dạng của các chủng Vibrio gây bệnh liên quan đến TPD và các chủng Vibrio gây bệnh tạm thời được đặt tên là Vibrio gây TPD (VTPD). 

Hình 3. Tái thiết phát sinh gen dựa trên các chuỗi rpoD, rctB và toxR được nối. Phần trăm giá trị bootstrap (1000 lần lặp lại). Các trình tự tham chiếu được căn chỉnh theo mô tả của Pascual 

Kết quả phát hiện VTPD bằng TaqMan qPCR và PCR 

Vào năm 2021 và 2022, các tác giả đã thực hiện một cuộc khảo sát dịch tễ học về TPD ở tôm thẻ chân trắng và các loài thủy sản khác ở Trung Quốc. Tổng cộng có 694 mẫu được thu thập từ các tỉnh khác nhau, bao gồm Thiên Tân, Hà Bắc, Sơn Đông, Giang Tô, Hồ Nam, Hồ Bắc, Chiết Giang, Quảng Tây, Hải Nam và Tân Cương. Sử dụng TaqMan qPCR để phát hiện các gen độc lực chính của VTPD trong các mẫu, chúng tôi nhận thấy tỷ lệ VTPD dương tính là 23,1% (160/694). Trong các mẫu tôm thẻ, tỷ lệ dương tính là 29,1% (135/463), trong khi ở các mẫu P. japonicus, tỷ lệ dương tính là 18,3% (11/60). Không tìm thấy kết quả dương tính trên các mẫu Macrobrachium rosenbergii và Procambarus clarkii. Ngoài ra, tỷ lệ dương tính của VTPD là 22,9% (14/61) trong các mẫu mực và tằm, nhưng không tìm thấy kết quả dương tính nào trong các mẫu Margarya melanoide (hoang dã) (Hình 4b). 

Các mẫu dương tính với VTPD đã được tìm thấy trong các vùng NTTS ở hầu hết các tỉnh ven biển của Trung Quốc, nhưng có sự khác biệt về mức độ phổ biến giữa các vùng (Hình 4d). Tỷ lệ nhiễm VTPD cao nhất được ghi nhận ở tỉnh Tân Cương với 93,33% (14/15), tiếp theo là tỉnh Quảng Tây với 52,90% (18/34) và tỉnh Hồ Nam với 42,9% (3/7). Số lượng mẫu lớn nhất đến từ tỉnh Sơn Đông và tỉnh Hải Nam, với tỷ lệ lưu hành VTPD lần lượt là 25% (64/256) và 28,66% (45/157). Tuy nhiên, không có mẫu dương tính với VTPD nào được phát hiện ở tỉnh Chiết Giang và tỉnh Hồ Bắc (Hình 4c). 

Phân tích mô bệnh học của các mẫu dương tính với VTPD trong TaqMan qPCR cho thấy rằng trong giai đoạn đầu của nhiễm trùng VTPD (Hình 5a, b), các tế bào biểu mô gan tụy tôm thẻ bị nhiễm bệnh đã co lại đáng kể và vi khuẩn tích tụ trong lòng. Trong các giai đoạn sau của nhiễm trùng (Hình 5c, d), cấu trúc gan tụy của tôm thẻ bị nhiễm bệnh đã bị tổn hại nghiêm trọng. Cấu trúc lòng hình elip hoặc hình tròn của ống gan tụy còn nguyên vẹn về cơ bản không được quan sát thấy. Các tế bào biểu mô của ống gan tụy bị hoại tử và bong ra (mũi tên đen).

Đồng thời, có thể quan sát thấy một số lượng lớn vi khuẩn đang xâm chiếm trong lòng (mũi tên đỏ). Sau đó, ở giai đoạn giữa của quá trình nhiễm trùng (Hình 5e), các tế bào biểu mô ruột bắt đầu bong ra (mũi tên đen) và một số lượng lớn vi khuẩn tập hợp lại và định cư trong lòng ruột (mũi tên đỏ). Khi việc nhiễm tiến triển, mức độ nghiêm trọng của tổn thương ruột giữa trở nên trầm trọng hơn. Trong giai đoạn sau của nhiễm trùng (Hình 5f), cấu trúc ruột giữa bị tổn thương nghiêm trọng và gần như tất cả các tế bào biểu mô đã bị bong ra (mũi tên đen). Toàn bộ mô ruột bị thu nhỏ lại chỉ còn lớp nền. 

Tóm lại, nghiên cứu này không chỉ cho thấy mức độ phổ biến của TPD ở các loài nuôi tôm chính ở Trung Quốc và điều tra tính đa dạng gây bệnh của nó mà còn khám phá mối quan hệ giữa các gen độc lực do VTPD mang theo từ các nguồn khác nhau và khả năng gây bệnh của chúng. Hiểu được sự tương tác phức tạp giữa các gen độc lực này và các cơ chế điều hòa của chúng là rất quan trọng để hiểu được các cơ chế làm tăng khả năng gây bệnh trong nhiễm trùng VTPD. Kiến thức này có khả năng dẫn đến các chiến lược có mục tiêu nhằm giảm thiểu tác động của các yếu tố độc lực này và nâng cao khả năng quản lý và kiểm soát các bệnh do VTPD gây ra trong môi trường nước. 

Hình 5. Kết quả mô bệnh học của tôm thẻ bị nhiễm TPD nhân tạo. 

(a) và (b) là các bức ảnh hiển vi nhuộm H&E của các mô gan tụy từ tôm thẻ bị nhiễm bệnh ở giai đoạn đầu hoặc giữa, (c) và (d) là các bức ảnh hiển vi nhuộm H&E của các mô gan tụy từ tôm thẻ bị nhiễm bệnh ở giai đoạn muộn, (e) là ảnh hiển vi nhuộm H&E của mô ruột của tôm thẻ ở giai đoạn đầu hoặc giữa, (f) là ảnh hiển vi nhuộm H&E của mô ruột của tôm thẻ ở giai đoạn muộn. Mũi tên đỏ biểu thị tế bào biểu mô gan tụy hoặc ruột hoại tử; mũi tên đen biểu thị các tế bào biểu mô gan tụy hoặc ruột bị bong ra; mũi tên trắng biểu thị khối vi khuẩn VTPD tập trung. (b) và (d) là các hình ảnh phóng to của (a) và (c), với tỷ lệ: (b), (d), (e) và (f) là 20 μm, (a) và (c) là 100 ừm. (Để giải thích các tham chiếu đến màu sắc trong chú giải hình này, người đọc có thể tham khảo phiên bản web của bài viết này.)