Ví dụ, 4-phenyl-2-thioxo-1,2,3,4-tetrahydro-chromeno[4,3-d]pyrimidin-5-one đã được sản xuất, cho thấy khả năng ức chế mạnh sự nhân lên của vi-rút gây bệnh mùa xuân ở cá chép, đạt mức cao tới 97% trong tế bào epithelioma papulosum cyprini (EPC) (Song et al., 2020). Coumarin 7-(6-benzimidazole) đã chứng minh khả năng ức chế đáng kể sự nhân lên của vi-rút hoại tử tạo máu truyền nhiễm (IHNV) trong tế bào EPC (Liu et al., 2021).
Để giải quyết nhu cầu cấp thiết về phòng ngừa và điều trị bệnh đốm trắng (WSD), trong nghiên cứu của Đại học Ninh Ba (Trung Quốc), các nhà khoa học đã thiết kế và tổng hợp một loạt các dẫn xuất coumarin mới. Sử dụng mô hình nhiễm vi-rút được thiết lập trong nghiên cứu trước đây đối với ấu trùng tôm thẻ chân trắng (Shan và cộng sự, 2021), nhóm tác giả đã đánh giá hoạt động kháng vi-rút của các dẫn xuất coumarin bằng cách xác định tỷ lệ ức chế của chúng đối với số lượng bản sao của WSSV và tác dụng bảo vệ của chúng đối với ấu trùng tôm bị nhiễm WSSV.
Thử nghiệm độc tính cấp tính và sàng lọc các dẫn xuất coumarin
Nghiên cứu đã tổng hợp 15 dẫn xuất coumarin mới, như được trình bày chi tiết trong Bảng 1. Các hợp chất này được đánh giá về hoạt tính chống WSSV và độc tính ở ấu trùng tôm. Nồng độ gây chết trung bình (LC50) và nồng độ hiệu quả trung bình (EC50) của các hợp chất được báo cáo trong Bảng 2. Đánh giá về độ an toàn cho thấy các nhóm thế làm tăng đáng kể độc tính của các hợp chất đối với ấu trùng tôm. Ngược lại, các hợp chất có 7 hydroxycoumarin làm vòng gốc thể hiện độc tính cao hơn so với các hợp chất có 7 aminocoumarin làm vòng gốc trong nghiên cứu này. Sau đó, các hợp chất hoạt động này được đánh giá bằng cách sử dụng qPCR để phát hiện số lượng bản sao WSSV.
Biểu đồ phân tán cung cấp tóm tắt về hiệu quả kháng vi-rút của từng hợp chất (Hình 1B). Các hợp chất được coi là có hiệu quả nếu chúng ức chế số lượng bản sao WSSV ≥ 50%. Trong số các hợp chất đã được sàng lọc, ba hợp chất đã được cấp phép để chống lại nhiễm trùng WSSV, cụ thể là N-(4-methyl-2-oxo-2H-chromen-7-yl)benzamide (P12), N-(4-methyl-2-oxo-2H-chromen-7-yl)acetamide (P13) và ethyl (4-methyl-2-oxo-2H-chromen-7-yl)- carbamate (P15). Để xác định thêm các hợp chất ứng cử viên tối ưu, một thử nghiệm đáp ứng liều đã được thiết kế.
Kết quả cho thấy các hợp chất hoạt động thể hiện hiệu quả khác nhau trong việc ức chế sự sao chép của WSSV: P12 (đáp ứng ức chế tối đa: 67,9%), P13 (92,5%) và P15 (62,9%) (Hình 1C). Thật vậy, độc tính và hoạt tính kháng vi-rút của coumarin đã thay đổi đáng kể do sửa đổi nhóm tại cùng một vòng gốc. So với P13, các hợp chất P12 và P15 thu được với phenyl và oxethyl, thể hiện hoạt tính kháng vi-rút không mong muốn.
Đáng chú ý, P13 đã chứng minh sự gia tăng đáng kể hoạt động chống lại WSSV, đạt giá trị EC50 là 11,4mg/L khi một nhóm methyl được đưa vào cuối liên kết. Tương tự như vậy, các hoạt động kháng khuẩn và chống ký sinh trùng của các hợp chất bị ảnh hưởng bởi liên kết carbon (Hu và cộng sự, 2018, Liu và cộng sự, 2016). Do đó, loại chất thay thế là một yếu tố quan trọng trong hoạt động kháng vi-rút của các hợp chất, cung cấp một chiến lược tiềm năng để thiết kế các hợp chất thay thế nhằm tối ưu hóa hoạt động sinh học của thuốc.
Ngoài ra, chúng tôi đã kiểm tra tác dụng bảo vệ của các hợp chất hoạt tính đối với ấu trùng tôm. Các hợp chất hoạt tính làm giảm hiệu quả tỷ lệ chết của ấu trùng tôm và kéo dài thời gian sống của chúng (Hình 1D).Do đó, xét đến việc P13 đã chứng minh tác dụng kháng vi-rút hiệu quả nhất, chúng tôi đã tiến hành phân tích kỹ lưỡng các đặc tính chống WSSV của P13. P13 được xác định bằng ESI-MS, 13C NMR và 1H NMR. Dữ liệu được hiển thị như sau: MS (ESI) m/z: 217 [M+Na]+. 13C NMR (126MHz, DMSO-d6) δ: 169,05, 160,00, 153,65, 153,05, 142,57, 125,81, 114,93, 114,77, 112,09, 105,33, 24,17, 17,93. 1H NMR（500MHz, DMSO-d6）δ: 10,36, 7,74, 7,70, 7,68, 7,68, 7,46, 7,44, 6,24, 2,39, 2,11, 2,10 (Hình S1).
Bảng 1. Danh sách các dẫn xuất coumarin
Hình 1: Kết quả Sàng lọc các dẫn xuất coumarin có hoạt tính kháng WSSV ở ấu trùng tôm.
(A) Sơ đồ mô tả quy trình làm việc. (B) Tỷ lệ phần trăm ức chế của số bản sao WSSV và các hợp chất được dán nhãn đỏ đã được kiểm tra hơn 50%. Nồng độ thể hiện trong hình là nồng độ sàng lọc được sử dụng cho từng hợp chất. (C) Số bản sao WSSV đã được thử nghiệm bằng cách tiếp xúc với P12, P13 và P15 lên đến 20 mg/L trong 72 giờ. Ấu trùng tôm bị nhiễm vi-rút được ngâm trong thuốc hoặc dung dịch DMSO. (D) Tỷ lệ chết cộng dồn của ấu trùng tôm bị nhiễm WSSV đã được phân tích trong các hợp chất và đồng xử lý WSSV với tôm. Mỗi giá trị được biểu thị dưới dạng giá trị trung bình ± Độ lệch chuẩn hóa thành giá trị không xử lý. Giá trị p cho mỗi nghiên cứu được xác định bằng kiểm định t của Student. **p < 0,01; *p < 0,05.
Tác dụng chống WSSV của P13
Để xác nhận thêm hoạt động kháng vi-rút của P13 đối với WSSV, các tác giả đã khám phá nhiều phương pháp dùng thuốc khác nhau. Như được mô tả trong Hình 2B, không có sự chênh lệch đáng kể nào về số lượng bản sao WSSV giữa nhóm WSSV và nhóm P13-WSSV khi ấu trùng tôm được ủ trước với P13. Xử lý trước bằng P13 không ức chế sự phát triển của WSSV và do đó không làm giảm tỷ lệ chết của ấu trùng tôm (Hình 2C). Tuy nhiên, P13 kéo dài thời gian sống của ấu trùng tôm lên 84 giờ, ngụ ý rằng ngay cả một lượng nhỏ thuốc còn lại trong ấu trùng tôm cũng có thể có một số tác dụng kháng vi-rút.
Một thí nghiệm điều trị bằng thuốc sau khi ấu trùng được tiến hành để nghiên cứu xem tác dụng kháng vi-rút của P13 có xảy ra sau khi xâm nhập hay không. Thí nghiệm này bao gồm việc lây nhiễm ấu trùng bằng WSSV và điều trị chúng bằng P13. Sau 24 giờ nhiễm, đã có một sự khác biệt đáng kể về số lượng bản sao WSSV đã được ghi nhận giữa nhóm WSSV và nhóm P13-WSSV, nhưng không có sự khác biệt trong nhóm lây nhiễm ấu trùng trong 48 giờ (Hình 3B). Dữ liệu tiếp theo hỗ trợ các quan sát từ các thử nghiệm tỷ lệ chết (Hình 3 C-D), cho thấy P13 vẫn tiếp tục phát huy tác dụng kháng vi-rút của nó ngay cả sau khi nhiễm WSSV trong 24 giờ.
Hình 2. Hiệu quả của tiền xử lý P13 được đánh giá đối với nhiễm WSSV
(A) Sơ đồ mô tả quy trình. (B) Số lượng bản sao WSSV được thử nghiệm trong tiền xử lý P13 với ấu trùng tôm trong 1, 4 và 8 giờ, sau đó là nhiễm WSSV. (C) Tỷ lệ chết cộng dồn của hậu ấu trùng bị nhiễm WSSV được phân tích trong tiền xử lý P13.
Hình 3. Hiệu quả điều trị của P13 được đánh giá trên nhiễm WSSV
P13 làm giảm sự lây nhiễm của WSSV
Một nghiên cứu về quá trình ủ trước của P13 với WSSV đã được tiến hành để bổ sung cho dữ liệu thu được từ quá trình xử lý trước và sau, nhằm mục đích nghiên cứu khả năng tương tác của P13 với các hạt virus, ngăn ngừa sự lây nhiễm của chúng đối với ấu trùng tôm. Các hạt WSSV ban đầu được xử lý bằng 20 mg/L P13, sau đó pha loãng để loại bỏ tác động của P13, sau đó virus được sử dụng để lây nhiễm ấu trùng. Nghiên cứu này đã thành công trong việc giảm đáng kể số lượng bản sao của WSSV (Hình 4B).
Các thí nghiệm về tỷ lệ chết đã hỗ trợ thêm cho ý tưởng rằng P13 làm suy yếu sự lây nhiễm của WSSV và có thể kéo dài sự sống sót của ấu trùng (Hình 4C). P13 tác động lên virion WSSV và làm giảm khả năng lây nhiễm của vi-rút, tương tự như những phát hiện trong các nghiên cứu trước đây (Balmer và cộng sự, 2017, Chen và cộng sự, 2018a, Chen và cộng sự, 2018b, Liu và cộng sự, 2020b). Điều này góp phần cải thiện đặc tính của các sản phẩm coumarin như chất ức chế điều trị chống lại WSSV hoặc trong quá trình phát triển vắc-xin.
Hình 4. Hiệu ứng của P13 được đánh giá trên các hạt WSSV
Hiệu quả của P13 trong môi trường nước
Để đánh giá ứng dụng của P13 trong NTTS, các tác giả đã kiểm tra tính ổn định của nó trong môi trường nước. Các mẫu nước có chứa P13 được ủ trong 0–4 ngày và sau đó tiếp xúc với WSSV (Hình 5A). Như mô tả trong Hình 5B, không có sự thay đổi đáng kể nào về tính bền bỉ của P13 trong giai đoạn 2 ngày đầu. Trong nhóm WSSVDMSO-0 ngày, tỷ lệ chết ấu trùng tích lũy đạt 100% trong vòng 72 giờ; tuy nhiên, P13 mới chế biến kéo dài thời gian sống sót lên 108 giờ (Hình 5C). Bằng chứng bổ sung về tính ổn định của P13 đã được quan sát thấy trong trường hợp chết 100% ở các mẫu nước có thuốc tại các thời điểm sớm hơn, minh họa ở 108 hpi của một ngày (Hình 5D), 108 hpi của hai ngày (Hình 5E), 96 hpi của ba ngày (Hình 5F) và 84 hpi của bốn ngày (Hình 5G). Thông tin này sẽ đóng vai trò là tài liệu tham khảo cho ứng dụng thực tế của thuốc.
Tóm lại, các tác giả đã thiết kế, tổng hợp và đánh giá tổng cộng 15 dẫn xuất coumarin về hiệu quả kháng vi-rút của chúng đối với WSSV. Các thử nghiệm đã cung cấp bằng chứng cho thấy một hợp chất mới, P13, đã chứng minh tác dụng kháng vi-rút đầy hứa hẹn đối với nhiễm WSSV ở ấu trùng tôm thẻ chân trắng. Nhìn chung, những phát hiện cho thấy P13 an toàn và có tiềm năng phát triển hơn nữa như một tác nhân kháng vi-rút mới để điều trị nhiễm WSSV.
_1734334030.jpg)
