Một dòng Vibrio campbellii mới mang gen pirVP gây hoại tử gan tụy cấp tính

*Chú thích hình: Phân lập thử nghiệm Vibrio campbellii mang gen pirVP liên quan đến bệnh AHPND ở tôm thẻ chân trắng.

(A) Phát hiện gen pirA và pirB. Vạch 1 và 5: Kết quả PCR từ tổng DNA của dòng 20130629003S01; Vạch 2 và 6: Các kết quả RT-PCR từ RNA dòng 20130629003S01; Vạch 3 và 7: Kết quả PCR từ DNA Plasmid tinh khiết của dòng 20130629003S01; Vạch 4 và 8: Đối chứng âm;

(B) tái tạo cấu trúc dựa trên ranh giới 16S rRNA, rpoD, rctB và toxR.

(C) phân tích điện cực gel SDS-polyacrylamide của PirA và PirB của dòng 20130629003S01.

(D) Dấu hiệu chung tôm nhiễm AHPND (trái): gan tụy nhợt nhạt, đường tiêu hóa rỗng. Tôm bình thường (phải): kích thước bình thường gan tụy có màu nâu và đường tiêu hóa đầy đặn.

(E) Gan tụy của tôm chân trắng Litopenaeus nhuộm với Hematoxylin và Eosin 

Cơ chế gây bệnh hoại tử gan tụy cấp tính (AHPND)

Trong những năm gần đây, bệnh hoại tử gan tụy cấp tính (AHPND) đã lan rộng nhanh chóng ở các nước châu Á và Mexico, gây ra tử vong trầm trọng (lên đến 100%) và làm suy giảm sản lượng tôm.

AHPND ban đầu được cho là do chủng Vibrio parahaemolyticus đặc hiệu, cụ thể là V. parahaemolyticus gây ra AHPND. V. parahaemolyticus trở thành VPAHPND độc hại sau khi có một plasmid (pVA1)  bao gồm hai tiểu đơn vị, PirA và PirB, đồng nhất với độc tố nhị phân Pir gắn vào. Plasmid pVA1 cũng mang một nhóm các gen liên quan đến chuyển đổi liên hợp; Do đó, plasmid này có thể có khả năng chuyển giao không chỉ giữa các chủng V. parahaemolyticus với nhau mà còn đối với các chủng vi khuẩn khác.

Cho đến nay, không có báo cáo nào được công bố trực tiếp chứng minh rằng Vibrio campbellii có thể chứa pirVP và gây AHPND trong tôm. Trong bài báo này, nhóm nghiên cứu đã thử nghiệm trên tôm thẻ chân trắng Litopenaeus với một dòng V. campbellii mới (20130629003S01) mang pirVP phân lập từ một trang trại tôm và chứng minh rằng dòng V. campbellii mới này là một tác nhân gây bệnh của AHPND. 

Dòng Vibrio campbellii mới mang gen pirVP gây hoại tử gan tụy cấp tính 

Một chủng loại mới với mã 20130629003S01 đã được phân lập từ tôm thẻ chân trắng ở Quảng Tây, Trung Quốc. Sự khuếch đại PCR và RT-PCR được thực hiện bằng các primer VpPirA và VpPirB đặc trưng cho gien pirVP (pirA và pirB). Kỹ thuật điện di các sản phẩm PCR cho thấy cả pirA (284 bp) và pirB (392 bp) đều được phát hiện trong máu tôm. Một chuỗi các phần của 16S rRNA thu được bằng cách sắp xếp các sản phẩm PCR thu được với primer 27F (5'-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3 ') và 1492R (5'-TAC GGC TAC CTT GTT ACG ACT T-3'). Cho thấy rằng chủng 20130629003S01 thuộc nhóm Vibrio và có họ hàng gần nhất với V. campbellii (99.72%) và V. rotiferianus (99.66%). 

Đáng chú ý, gen pirVP được khuếch đại thành công bằng cách sử dụng DNA plasmid chiết xuất từ V. campbellii (20130629003S01). Ngoài ra, trình tự thế hệ tiếp theo của dòng 20130629003S01 đã chứng minh rằng có một plasmid chứa pVA1 và pirVP. 

Mức độ gây bệnh của giống 20130629003S01 được kiểm tra ở tôm chân trắng khỏe mạnh có trọng lượng khoảng 1 g, được nuôi trong nước biển nhân tạo ở độ mặn 30^o/_oo trong bể composite (mật độ 15 con/bể) ở 27 ± 2°C. Một thử nghiệm ngâm nhằm mục đích lây nhiễm dòng V. campbellii (20130629003S01) được sử dụng, tất cả các nhóm thí nghiệm được khảo sát trong ba lần. Tôm được gây nhiễm dòng 20130629003S01 bắt đầu xuất hiện các dấu hiệu tổng thể của AHPND trong vòng 12 giờ, tỷ lệ tử vong lớn xảy ra sau 12 giờ tiếp sau đó, đạt 100% trong vòng 36 giờ. Các dấu hiệu của tôm chân trắng bị nhiễm dòng 20130629003S01 bao gồm dạ dày và đường tiêu hóa rỗng cũng như gan tụy nhợt nhạt và teo nhỏ. 

Nghiên cứu này là lần đầu tiên chứng minh rằng một dòng V. campbellii mang pirVP gây ra AHPND. Vì vậy, bệnh hoại tử gan tụy cấp AHPND không phải chỉ do V. parahaemolyticus cần được nghiên cứu thêm.